蛋白鑒定分析ppt課件-資料下載頁
2025-05-03 06:01本頁面
【正文】 一般的離子交換色譜中 ， pH梯度的產(chǎn)生 ， 通常利用 pH梯度混合器來制造連續(xù)的 pH梯度 。 而聚焦色譜則是利用離子交換劑本身的帶電基團(tuán)的緩沖作用形成梯度 。 當(dāng)洗脫緩沖液通過聚焦離子交換介質(zhì)時(shí) ， 就會(huì)自動(dòng)形成 pH梯度 。 在高 pH緩沖液的平衡 ， 使色譜柱內(nèi)的介質(zhì)均處于堿性條件 ， 帶有電負(fù)性的堿性基團(tuán) ， 根據(jù)載體兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)不同 ， 所帶的電荷有差異而形成 pH梯度 。 (2)聚焦效應(yīng) 當(dāng)一種蛋白質(zhì)在色譜柱內(nèi)隨洗脫液前移至接近其 pI處時(shí) ,此時(shí)的移動(dòng)速度明顯減慢 。 如果同樣的組分第二次加樣 ， 起初它帶負(fù)電荷 ,向正電荷 (低 pH)方向移動(dòng)速度快 ， 直至追上慢速移動(dòng)的第一次加樣的組分 ， 而聚焦到一起 ， 然后兩次加樣的同一組分一起前移 ， 直至停留在 pI處 。 . 2 聚焦介質(zhì) 聚焦介質(zhì)是以交聯(lián)的瓊脂糖凝膠為載體合成的 ,具有凝膠介質(zhì)的基本特性 ， 也有兩性電解質(zhì)的特性 。 目前用的較多主要 (1)PBE118偏堿性介質(zhì) (2)PBE94偏中性介質(zhì) (1)緩沖液分類 (start buffer)， 如：乙醇胺 HCl (sample buffer), 如： TrisHAc (eluting buffer), 如： polybuffer 96HCl (1)始緩沖液及洗脫緩沖液的配制方法 介質(zhì) pH范圍 起始緩沖液 PBE118() 三乙胺 HCl PBE 94(pH96) 乙醇胺 HCl PBE 94(pH85) TrisHCl PBE 94(pH74) 咪唑 HAc PBE 94(pH64) 組氨酸 HCl PBE 94(pH54) 哌嗪 HCl (2) 洗脫緩沖液的配制方法 表二洗脫緩沖液的配制方法 介質(zhì) pH范圍 Polybuffer pH 稀釋液 柱體積 : 洗脫體 Exchanger PBE118(pH107) Pharmalyte pH87 1:45 1:13 Exchanger PBE 94(pH96) Pharmalyte或 Polybuffer 96 pH76 1:45,1:10 1:12 Exchanger PBE 94(pH85) Polybuffer pH75 1:10 1:10 Exchanger PBE 94(pH74) Polybuffer96 或 Polybuffer74 pH64 1:10,1:8 1:14 Exchanger PBE 94(pH64) Polybuffer 74 pH54 1:8 1:10 Exchanger PBE 94(pH54) Polybuffer 74 1:10 1:12 聚焦層析柱 → 起始緩沖液 → 上樣 → 多聚緩沖液 → 再生溶液 ： (1) 樣品中不能含有無機(jī)鹽 (2) 根據(jù)蛋白質(zhì)不同的等電點(diǎn)選擇合適的聚焦介質(zhì)和緩沖液 。 在一定情況下，離子交換劑吸附物質(zhì)的量和在溶液中游離的物質(zhì)量達(dá)到平衡時(shí)，二者物質(zhì)的質(zhì)量之比稱為分配系數(shù)（平衡常數(shù)），以 Kd表示： Kd＝ Ms/M Ms 單位重量的離子交換劑 Ml 單位體積溶液中溶質(zhì)的摩爾數(shù) 設(shè)溶液中存在著 A、 B兩種物質(zhì) ， 當(dāng)它們進(jìn)行離子交換色譜時(shí) ， 原來吸附在離子交換劑上的離子被高濃度的 A、 B物質(zhì)交換并被洗脫下來 。由于 A、 B兩種物質(zhì)在同一溶液中的解離度不同 ， 它們的電荷有差異 ，因此二者的遷移速度不同 。 由上樣的起始點(diǎn) (原點(diǎn) )至 A、 B兩組波峰的間距加大 ， 最終形成兩個(gè)波峰 。 離子交換柱 → 平衡 → 上樣 → pH梯度洗脫 → 測定洗脫峰 pH值 (1)受離子交換劑非極性親和力及兩者空間關(guān)系的影響 ， 尤其是分離的生物分子有一定的空間阻礙 (2)受溶液 pH值影響 ， pH值變化會(huì)影響溶質(zhì)解離度的變化 ， 從而影響溶質(zhì)的交換量 (3)受被分離物質(zhì)中具有相反電荷離子影響 , 被分離物質(zhì)與溶液中反離子靜電引力形成的離子鍵 ,具有阻止樣品與交換劑活性基團(tuán)的交換作用 . (4)鹽離子的影響：鹽離子濃度增加 ， 鹽離子與被分離物的親和力增大 ， 從而降低了被分離物質(zhì)與離子交換劑的親和力 ， 導(dǎo)致已結(jié)合上去的物質(zhì)被洗脫下來 。 小結(jié) 方法 機(jī)理 等電點(diǎn)計(jì)算 關(guān)鍵技術(shù) 特點(diǎn) 電泳 電場下 pH梯度分離 電泳條帶相對(duì)位置 游離 pH梯度 到達(dá)等電點(diǎn)停止運(yùn)動(dòng) 聚焦層析 液相層析 pH梯度分離 層析峰的相對(duì)位置 固相 pH梯度 到達(dá)等電點(diǎn)后解吸 離子交換 同性電荷交換 層析峰的相對(duì)位置 pH梯度洗脫 等電點(diǎn)洗脫峰
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