【正文】 ，而大多數(shù)非極性側(cè)鏈總是埋在分子內(nèi)部形成 疏水核 。 (3) 球狀蛋白質(zhì)的表面往往有內(nèi)陷的空穴，空穴周圍有許多疏 水側(cè)鏈，是 疏水區(qū) ，這空穴往往是 酶的活性部位或蛋白質(zhì) 的功能部位 。 structure (四級(jí)結(jié)構(gòu) ) 四級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)的亞基聚合成大分子蛋白質(zhì)的方式 （ 亞基是指一條多肽鏈或以共價(jià)鏈連接在一起的幾條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子的最小共價(jià)結(jié)構(gòu)單位 ） 。 (1) 定義： The spatial arrangement of multiple subunits of a protein is referred to as the quaternary structure. ? Proteins need to have two or more polypeptide chains to function properly. ? Each individual polypeptide of the plete tertiary structure is called subunit (亞基 ). ? These subunits are associated by Hbonds, ionic interactions, and hydrophobic interactions. ? Polypeptide chains can be in dimer (二聚物 ), trimer (三聚物 ).., as well as homo (同 性 ) or hetero (異性 ) form. Ionic forces among Hb subunits Hemoglobin Myoglobin Mathews et al (2022) Biochemistry (3e) Mathews et al (2022) Biochemistry (3e) 小結(jié) 三、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)是由氨基酸組成，因此蛋白質(zhì)的性質(zhì)與氨基酸相似，但由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過(guò)肽鍵形成了大分子化合物，也就出現(xiàn)了一些新的性質(zhì)。 （一）膠體性質(zhì) 由于蛋白質(zhì)分子很大，在水中形成膠體溶液。蛋白質(zhì)主要是指球狀蛋白質(zhì)有親水面，它的親水基團(tuán)都在表面，因此與水有很大的親和力，成為 親水膠體 。 蛋白質(zhì)的親水膠體溶液是相當(dāng)穩(wěn)定的，一方面由于蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)會(huì)吸引它周圍的水分子，使水分子定向排列在它的周圍，形成 “ 水化層 ” 。另一方面由于蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)帶有同種 電荷 ，同種電荷相斥，也使蛋白質(zhì)分子保持一定的距離而不會(huì)聚合。 ++++++++++++蛋白質(zhì)膠體顆粒的沉淀 + + + + + + + + （ 沉淀 ） （疏水膠體） （疏水膠體） （二）酸堿性質(zhì)和等電點(diǎn) 1. 蛋白質(zhì)分子的可解離基團(tuán) 2. 等電點(diǎn) 在某一 pH值時(shí)，蛋白質(zhì)所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，即凈電荷為零，此時(shí)溶液的 pH值就是蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 每種蛋白質(zhì)都有它特有的等電點(diǎn)，這也是鑒別蛋白質(zhì)的指標(biāo)之一。 蛋白質(zhì)的酸性氨基酸和堿性氨基酸含量與等電點(diǎn)的關(guān)系 : 等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)分子中所含氨基酸的種類有關(guān)。 3. 等離子點(diǎn) 等離子點(diǎn) 是蛋白質(zhì)在不含其它溶質(zhì)的純水中，蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零時(shí)的溶液的 pH值。等離子點(diǎn)是一個(gè)常數(shù)。 4．蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定 等電聚焦 （三）電泳 (Electrophoresis) 移動(dòng)的速度 v = E Z f ? The charges and the molecular weights will determine their moving velocity in the electric field, leading to the separation of different proteins. ? The gel polymer material for protein separation is posed of methylenebisacrylamide and acrylamide. ? The pore size can be controlled by changing the concentration of crosslinking reagent. ? The gel with different concentration of crosslinking reagent can be used for different size proteins. ? Sodium dodecyl sulfate (SDS) is added into the protein solution to denature the protein. ? Anions of SDS bind to protein in the ratio of 1 SDS per 2 AAs. ? The proteinSDS plex is roughly charged proportional to the mass. ? The smaller the protein, the faster the moving speed. (四 ) 變性作用（ denaturation） 1．變性的概念和理論 概念：變性是指蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，使蛋白質(zhì)分子原有的特定的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變以及生物活性的喪失。 理論：吳憲提出 肽鏈從緊密有序結(jié)構(gòu) → 松散無(wú)序的結(jié)構(gòu) 2．變性的因素 物理因素 : 加熱、紫外線、 X射線、超聲波等。 化學(xué)因素 : 酸、堿、有機(jī)溶劑、蛋白變性劑（尿素、鹽酸 胍）、重金屬鹽等。 3．變性蛋白質(zhì)的特性 （ 1）生物活性全部或部分喪失 （ 2）一些側(cè)鏈基團(tuán)暴露，可滴定基團(tuán)增加 （ 3）一些物理化學(xué)性質(zhì)的改變 （ 4）生化性質(zhì)的改變 4．變性的可逆性 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu) （五）凝固作用 變性蛋白質(zhì)互相凝聚或互相穿插在一起的現(xiàn)象稱蛋白質(zhì)的凝固。 （六）沉淀作用 1．加酸沉淀蛋白質(zhì) 2．加中性鹽沉淀蛋白質(zhì) 3．加有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì) 4．加重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì) 5．加生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì) （七）沉降作用 什么是沉降？ 沉降速度：指離心時(shí)，蛋白質(zhì)分子在單位時(shí)間內(nèi)下沉的距離。 t： 時(shí)間（ sec） x： 下沉的距離（ cm） v = dx dt 沉降常數(shù)（沉降系數(shù)） ：當(dāng)沉降界面以恒速移動(dòng)時(shí)，單 位離心場(chǎng)中的沉降速度。 xwvs2?s： 沉降常數(shù) v： 沉降速度（ cm/sec）w： 離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的角速度（弧度 /sec） x： 蛋白質(zhì)界面中點(diǎn)離旋轉(zhuǎn)中心的距離，以 cm計(jì)。 瑞典的蛋白質(zhì)化學(xué)家 1S=1013秒。 （一）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 1．鐮刀狀紅細(xì)胞貧血?。?sicklecell anemia） 四、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 Observed Normal range Red cell count 106/ml ～ 106/ml Hemoglobin content 8g/100ml 14～ 18g/100ml White cell count 15,250/ml 4,000～ 10,000/ml HbA β鏈： ValHisLeuThrProGluGluLys… HbS β鏈： ValHisLeuThrProValGluLys… HbA（ adult hemoglobin） HbS（ sicklecell hemoglobin） 2．激素和它的前體分子 胰島素和它的前體 （二）蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 以血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)為例說(shuō)明蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 1．血紅蛋白中血紅素輔基的結(jié)構(gòu) 2．血紅素中的 Fe2+與氧結(jié)合前后價(jià)數(shù)不變 3．血紅蛋白與氧的結(jié)合 4．血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng) (變構(gòu)效應(yīng) )（ allosteric effect） 氧合作用顯著改變 Hb的四級(jí)結(jié)構(gòu)，血紅素鐵的微小移動(dòng)導(dǎo)致血紅蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)換（從 T態(tài) →R態(tài)） T態(tài)（ tense state） 緊張態(tài) R態(tài)（ relaxed state） 松馳態(tài)。 血紅蛋白是由兩個(gè) α 亞基和兩個(gè) β 亞基組成的四聚體（ α 2β 2）， 有穩(wěn)定的四級(jí)結(jié)構(gòu)，與氧的親和力很弱，但當(dāng)氧與血紅蛋白分子中一個(gè)亞基的血紅素輔基的鐵結(jié)合后。即引起該亞基構(gòu)象的改變，一個(gè)亞基構(gòu)象的改變又會(huì)引起其余亞基的構(gòu)象相繼發(fā)生改變，亞基間的次級(jí)鍵被破壞，結(jié)果整個(gè)分子從緊密的構(gòu)象變成比較松散的構(gòu)象，易于與氧結(jié)合，使血紅蛋白與氧結(jié)合的速度大大加快。 別構(gòu)效應(yīng) 是指含亞基的蛋白質(zhì)分子由于一個(gè)亞基構(gòu)象的改變而引起其余亞基以至整個(gè)分子構(gòu)象、性質(zhì)和功能發(fā)生變化。 5．波耳（ Bohr） 效應(yīng) H+和 CO2促進(jìn) HbO2釋放 O2 6. 2， 3一二磷酸甘油酸對(duì) Hb氧合的影響 Or 2, 3 Bisphosphoglycerate (BPG) Garrett amp。 Grisham (1999) Biochemistry (2e) substrate product 蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞生理反應(yīng) 螺旋可以組合成更復(fù)雜的的構(gòu)造 Garrett amp。 Grisham (1999) Biochemistry (2e) 可自 動(dòng)組 合的病毒外 殼 蛋白 Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.153 五、蛋白質(zhì)的分離、純化和鑒定 一般包括五步 （一）細(xì)胞破碎 有機(jī)械方法如高速組織搗碎器、玻璃勻漿器、在研缽中或球磨機(jī)上磨等。還有超聲法、反復(fù)凍融法、自溶等方法。 （二）抽提 根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性用適當(dāng)溶劑來(lái)抽提，總的原則是要制備的蛋白質(zhì)溶在什么溶劑中就用什么溶劑來(lái)抽提。 （三）分離 1．鹽析法 在蛋白質(zhì)的抽提液中加入一定量的中性鹽，使蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)，常用的中性鹽為 (NH4)2SO NH4Cl等。 2．有機(jī)溶劑沉淀法 常用的是乙醇、丙酮。 3．等電點(diǎn)沉淀 利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小這一特性，可以調(diào)溶液的 pH， 盡量接近它的等電 點(diǎn)，而使蛋白質(zhì)沉淀。 4．吸附法 吸附法是利用各種吸附劑和蛋白質(zhì)結(jié)合能力（吸附能力）的不同來(lái)分離蛋白質(zhì)。 5．透析和超濾 超濾法是最近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù)，利用分子大小不同，來(lái)分離蛋白質(zhì)。 透析 （四）純化 1．離子交換層析 離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進(jìn)行分離純化。常用的陽(yáng)離子交換劑為羧甲基纖維素（ CMC），陰離子交換劑為二乙氨基乙基纖維素（ DEAEC）。 2．凝膠過(guò)濾 也稱分子排阻層析、分子篩層析，這是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來(lái)分離純化蛋白質(zhì)的一種方法。 常用的凝膠 : 葡聚糖凝膠（商品名 Sephadex） 聚丙烯酰胺凝膠 (商品名 BioGelP) 瓊脂糖凝膠 (商品名因生產(chǎn)廠家而 不同 ) 4．親和層析 這是根據(jù)蛋白質(zhì)能與特異的配體相結(jié)合而設(shè)計(jì)的一種方法。 蛋白質(zhì) ＋ 配體 蛋白質(zhì)配體復(fù)合物 3．高效液相層析（ HPLC） 這種分離純化方法由于專一性強(qiáng)，理論上可以從復(fù)雜的體系中一步提取所需的物質(zhì)。 5. 疏水層析 6. 電泳 7. 結(jié)晶 （五）鑒定 1．純度鑒定 常用的方法有電泳法、超離心法等。 還有恒溶度法 2．分子量確定 （ 1） SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE） SDS（ 十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，帶有很多負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合以后，蛋白質(zhì)分子帶有足夠的負(fù)電荷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷，蛋白質(zhì)分子原有的電荷就變得無(wú)足輕重了，所以在電場(chǎng)上 移動(dòng)的速度完全