沉淀技術(shù)ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-01 05:36本頁(yè)面
【正文】 因?yàn)闊o(wú)毒，不可燃性且對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)有保護(hù)作用。 PEG沉淀法能在室溫下進(jìn)行，得到的沉淀顆粒較大，收集容易。 ? PEG的分子量需大于 4000，最常用的是 6000和 20 000。所用的PEG濃度通常為 20％，濃度再高，會(huì)使粘度增大，造成沉淀的回收比較困難。 PEG對(duì)后續(xù)分離步驟，影響較少，因此可以不必除去。但它的存在會(huì)干擾 A280和 Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)． Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 43 第三章 沉淀技術(shù) 優(yōu)點(diǎn)：室溫條件下操作；沉淀的顆粒往往比較大；不容易破壞蛋白質(zhì)活性 。 缺點(diǎn)：所得的沉淀中含有大量的 PEG Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 44 第三章 沉淀技術(shù) ? 其他沉析技術(shù) 一、成鹽沉淀法 ：蛋白質(zhì)在堿性溶液中帶負(fù)電荷，能與金屬離子形成金屬?gòu)?fù)合鹽沉淀。常用的金屬離子 Zn2+ 、 Ca2+ 、 Pb2＋ ：含氮有機(jī)酸如苦味酸和鞣酸等能夠與有機(jī)分子的堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。 ：磷鎢酸、磷鉬酸等能與陽(yáng)離子形式的蛋白質(zhì)形成溶解度極低的復(fù)合鹽，從而使蛋白質(zhì)沉淀析出 特點(diǎn)： 常使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的沉淀，應(yīng)用時(shí)必須謹(jǐn)慎。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 45 第三章 沉淀技術(shù) 二、選擇性變性沉淀法 選擇變性沉析法原理是利用蛋白質(zhì)、酶與核酸等生物大分子對(duì)某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，而有選擇地使之變性沉析，以達(dá)到目的物與雜蛋白分離的技術(shù)，稱(chēng)為選擇變性沉淀。 選擇性熱變性 選擇性酸堿變性 選擇性變性劑 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 46 第三章 沉淀技術(shù) 熱沉淀 定義 在較高溫度下，熱穩(wěn)定性差的蛋白質(zhì)將發(fā)生變性沉淀，利用這一現(xiàn)象，可根據(jù)蛋白質(zhì)間的熱穩(wěn)定性的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)的熱沉淀，分離純化熱穩(wěn)定性高的目標(biāo)產(chǎn)物。 適用對(duì)象 ：熱穩(wěn)定性高的蛋白質(zhì) Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 47 第三章 沉淀技術(shù) 實(shí)例 酵母干粉中加入 mol/L磷酸氫二鈉溶液， 37℃水浴保溫 2 h，室溫?cái)嚢?3 h，離心收集上清液，升溫至 55℃ ，保溫 20 min后迅速冷卻離心去除熱變性蛋白，上清液中多為熱穩(wěn)定性較高的醇脫氫酶。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 48 第三章 沉淀技術(shù) 第三節(jié) 沉淀技術(shù)的應(yīng)用 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)（酶）的純化在粗分離階段常用到沉淀技術(shù)，以鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、多聚物沉淀的應(yīng)用最廣泛。 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 49 第三章 沉淀技術(shù) 棉鈴蟲(chóng)谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ glutathione Stransferase， GST）的純化 聚乙烯亞胺（ PEI） +硫酸銨 +PEG+親和層析，棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)中的 GST PEG10000PEG20220(NH4)2SO4 ? 多種沉淀技術(shù)的結(jié)合使用 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 50 第三章 沉淀技術(shù) β 甘露聚糖酶（ β mannanase） 枯草芽孢桿菌發(fā)酵 丙酮沉淀 /(NH4)2SO4/PEG 比較后丙酮最佳 ? 不同沉淀技術(shù)的比較 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 51 第三章 沉淀技術(shù) 核酸 ? 核酸的高電荷磷酸骨架（ 3）比蛋白質(zhì)，多糖等更具親水性 ? PEG應(yīng)用于 DNA沉淀已普遍（ 磷酸緩沖液中 PEG濃度 10%） ? 酚、氯仿抽提后（變性蛋白質(zhì)），乙酸鈉中和磷酸骨架負(fù)電荷（降低其親水性，促聚集），乙醇可有效沉淀 DAN（有機(jī)溶劑沉淀） ? 分子克隆第三版 Anhui University of Technology and Science Teaching and Research Section Department of Biochemical Engineering 52 第三章 沉淀技術(shù) 多糖 多糖提取的初級(jí)階段多用到乙醇沉淀或乙醇分級(jí)沉淀，選擇性沉淀（ TCA）去除多糖中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。 教材例子
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