【正文】 ADH3C o AS HC o AS H2 NAD NADH乳酸 丙酮酸乙酰乙酰 C o AC o AS HNADH乙酰 C o ACO 21. 脫氫酶 HB 合成酶2. 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體4. 乙酰乙酰 C o A 酮硫解酶3 羥基丁酰 C o AP HBC o AS HNA DP HNADP1 2345NAD丁酸 丁酰 C o A 2 烯丁酰 C o AA TP A M P + 2 P iC o A S HF A D 2F A D HH O21. 硫激酶 2. 脫氫酶 3. 水化酶 4. 聚合酶H O23 羥基 丁酰 C o A( D 型 )P H BC o A S H3 羥基丁酰 C o A( L 型 )3 酮 丁酰 C o AN A D N A D H1 2 34 (3)不同有機酸對 PHAs的產(chǎn)率與理論產(chǎn)率的比較 不同有機酸對 PHAs的產(chǎn)率與理論產(chǎn)率的比較 一步法碳源 N AD P H 再生 P H As Yp ct h eo r/( )/ g ? g 1Yp c/Y c e ll c/兩步法Yp c/乙酸 異檸檬酸 P H B 0. 48 0. 12 0. 24 0. 27丙酸 異檸檬酸 P H B V 0. 58 ～ 0. 68 0. 18 0. 19 0. 32乳酸 不需要 P H B 0. 48 0. 19 0. 16 0. 33丁酸 異檸檬酸 P H B 0. 65 0. 32 0. 14 0. 41 在一步發(fā)酵法中，由于所消耗的有機酸有一部分用于合成細胞的合成，因而四種有機酸對 PHAs的實際產(chǎn)率均小于兩步法，但它們對 PHAs和細胞的產(chǎn)率之和卻大于兩步法的產(chǎn)率 (4) 產(chǎn)酸相產(chǎn)物分布及其影響因子的研究 (a) HRT對酸化產(chǎn)物分布的影響 度濃酸機有丙酸乳酸丁酸乙酸HRT對酸化產(chǎn)物分布的影響 (b) 不同 pH條件下 UASB反應(yīng)器出水產(chǎn)物分布 pH度濃量質(zhì)酸水出U A S B 反應(yīng)器中 pH 值對出水酸分布的影響 丁酸 乙酸 丙酸 乳酸 4. 不同初始酸濃度對 PHAs發(fā)酵過程的影響 t不同初始酸濃度對 細胞干重 的影響初始酸濃度∶ ○ 5 g / L ；□ 1 0 g / L ；? 1 5 g / L ； 2 0 g / L ；◇ 2 5 g / L當硫酸銨濃度為 ，初始酸濃度在 20g/L左右較佳 ta c e ti c a c i dtbu tyr ic aci dpr op i on i c aci d乙酸、丁酸和丙酸濃度與發(fā)酵時間的關(guān)系初始酸濃度∶ ○ 5 g / L ；□ 1 0 g / L ；? 1 5 g / L ； 2 0 g / L ；◇ 2 5 g / L丁酸消耗速率大大超過乙酸和丙酸的消耗速率 , 當初始酸濃度為 5 、 1 20和 25 g/L時，最終發(fā)酵液中殘留的丁酸濃度為 ∶ 0、 、 、 PHAs濃度的變化 殘留細胞量隨時間的變化 初始酸濃度 : ○ 5 g/L。 □ 10 g/L。 ? 15 g/L。 20 g/L。◇ 25g/L t 5. PHAs分批發(fā)酵動力學(xué) (1)細胞生長動力學(xué) ))/(1(/ NCNC ssssss ????C / N 對細胞生長速率的影響○為實驗值，曲線代表模型計算值 (2) PHAs形成模型 RR xdtdxdtdp ??t /hPH As 積累與模型計算值的比較○為實驗值，曲線代表模型計算值 6. 以有機廢水酸化產(chǎn)物為底物進行 PHAs流加發(fā)酵 （ 1）流加發(fā)酵過程曲線 將 UASB出水中的總有機酸濃度濃縮至 150 g/L左右，進行 PHAs生產(chǎn)的 流加發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果見圖 t / h度濃量質(zhì)的質(zhì)物各流加發(fā)酵過程中 DC W 、 P HA s 、 NH 4 + 、有機酸的濃度變化□ DCW ； P HA ；? 丁酸；● 乙酸；? 丙酸；■ NH 4 + (2)酸化廢水發(fā)酵過程中丁酸對 PHAs的產(chǎn)率的變化 酸丁發(fā)酵時間酸丁發(fā)酵時間分批發(fā)酵過程中丁酸對 P H A s 的產(chǎn)率變化流加發(fā)酵過程中丁酸對 P H A s 的產(chǎn)率變化 四 . 生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng) 生物反應(yīng)與分離 (或分配 )相組合的技術(shù)： 選擇性地從培養(yǎng)液中連續(xù)分離有抑制性、有毒性或不穩(wěn)定性產(chǎn)物，或者將底物以一種可控的方式添加到培養(yǎng)液中，對生物反應(yīng)過程都能產(chǎn)生極大的促進作用 生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng)也稱為原位 (in situ)產(chǎn)物分離過程或提取生物轉(zhuǎn)化，即在生物反應(yīng)發(fā)生的同時，選擇一種合適的分離方法及時將對生物反應(yīng)有抑制或毒害作用的產(chǎn)物或副產(chǎn)物選擇性地從生產(chǎn)性細胞或生物催化劑周圍移走 生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng)具有如下三個特征： (1)耦合過程是一種集成式單元操作，其生物反應(yīng)器具有特殊的結(jié)構(gòu) (2)實現(xiàn)產(chǎn)物及時分離的方法有很多，但必須考慮產(chǎn)物的特性及具體的生物反應(yīng)體系來合理選擇和設(shè)計 (3)耦合過程作為一種新的反應(yīng)工程技術(shù)，可適用于各種生物反應(yīng)過程 分離技術(shù)的選擇主要基于四個方面的因素： (1)分離技術(shù)應(yīng)當具備生物相容性，適宜的分離技術(shù)應(yīng)當對生物反應(yīng)不造成負面影響，不會造成生物催化劑或細胞的失活、變性和死亡，也不會改變生物反應(yīng)的代謝和調(diào)節(jié)機制； (2)應(yīng)當考慮產(chǎn)物或副產(chǎn)物的物理化學(xué)特性和生物學(xué)特性； (3)考慮系統(tǒng)的流體特性，因為流體力學(xué)性質(zhì)決定并影響分離過程的傳質(zhì)，從而影響分離的容量和速度，如高粘度的非牛頓型流體就不能用膜分離技術(shù)；(4)考慮工程及經(jīng)濟因素，理想的分離技術(shù)應(yīng)當是操作費用低、性能穩(wěn)定、工程上易于實現(xiàn)的技術(shù) 1. 隨程溶劑萃取 ? 包括內(nèi)部隨程萃取和外部隨程萃取兩種方式 (1) 內(nèi)部隨程萃取是指萃取劑在反應(yīng)器中與培養(yǎng)基直接接觸，以便將產(chǎn)物萃取到溶劑中去 (例如，在利用帚狀地霉發(fā)酵生產(chǎn)酯類風(fēng)味物質(zhì)的研究中，內(nèi)部溶劑萃取技術(shù)得到了很好的應(yīng)用 ) ? 內(nèi)部溶劑萃取的特點是 ∶ 溶劑和液相混合均勻，因而有利于傳質(zhì)的進行；但溶劑也可能在培養(yǎng)液中形成穩(wěn)定的乳化作用，這對溶劑與產(chǎn)物的分離不利 (2) 外部隨程萃取是指萃取劑和培養(yǎng)液在反應(yīng)器外的萃取裝置中逆流接觸，從而萃取產(chǎn)物的過程 164。 用這種方法可以減輕內(nèi)部溶劑萃取中的乳化問題 164。 假如用己烷進行內(nèi)部溶劑萃取時，因為在發(fā)酵系統(tǒng)中加入揮發(fā)性溶劑，會導(dǎo)致傳氧困難，即便細胞處于產(chǎn)物合成的旺盛期也會減少產(chǎn)物的生成，即所謂的“相毒性” (phase toxocity)。外部隨程萃取則不存在這一問題，在外循環(huán)中多余的溶劑可用氣體抽提去除，若細胞對溶劑敏感，還可在微量溶劑回流反應(yīng)器前進行脫氣處理 2. 滲透萃取 ? 滲透萃取是一種基于膜技術(shù)的萃取系統(tǒng) ? 膜技術(shù)在萃取中具有能夠增加傳質(zhì)面積和降低乳化程度及減輕溶劑對微生物的毒害作用的優(yōu)點 ? Solichien采用氧化三辛基膦 (TOPO)與煤油的復(fù)合體系作為溶劑，由于萃取劑和培養(yǎng)液被膜隔開，萃取劑對細胞的毒性有所降低 ? 例如，在丙酸、乙酸和 乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，利用滲透萃取技術(shù)可降低產(chǎn)物對微生物的毒害作用，從而大大提高發(fā)酵水平 3. 滲透蒸發(fā) ? 滲透蒸發(fā)技術(shù)具有分離因子高、操作費用低、對膜結(jié)構(gòu)的無限制性及操作時具有較高的機械強度等優(yōu)點 ? 例如，在乙醇生產(chǎn)中，滲透蒸發(fā)是將乙醇從發(fā)酵液中連續(xù)分離的最有效手段，由于降低了產(chǎn)物抑制和分離操作費用，生產(chǎn)率得以顯著提高 ? Susumu等人采用聚二甲基硅氧烷中空纖維膜(PDMS─HF)結(jié)合氮氣作為載氣，可從水相中連續(xù)分離乙醇和異丙醇 4. 其它生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離技術(shù) ? (1) 氣體抽提 ? (2) 吸附 ? (3) 結(jié)晶 ? (4) 層析技術(shù) ? (5) 電滲析 ? (6) 動電技術(shù) ? (7) 受控底物分配 ? (8) 在酶學(xué)上的應(yīng)用 5. 生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離組合系統(tǒng)的發(fā)展趨勢 ? (1) 目前的研究更加深入和細化，包括 : ? (a)有抑制或毒害作用副產(chǎn)物的選擇性分離； ? (b)選擇性地供給營養(yǎng)底物； ? (c)不可發(fā)酵底物或老齡化細胞的分離 ? (2) 新的分離技術(shù)不斷出現(xiàn)，主要體現(xiàn)在 : ? (a)新的選擇性更強、生物相容性更好的生化分離方法的開發(fā)和應(yīng)用 (如基于分子識別的分離方法 )； ? (b)將傳統(tǒng)分離技術(shù)組合使耦合系統(tǒng)的選擇性更好、效果更理想，如前面介紹的膜技術(shù) 代謝工程 一、代謝工程概述 代謝工程的基本理論及應(yīng)用策略的形成： ，經(jīng)濟、合理地利用和合成自身所需的各種物質(zhì)和能量，使細胞處于平衡生長狀態(tài)。 ，活細胞這種自身固有的代謝網(wǎng)絡(luò)的遺傳特性并不是最佳的。為了大量積累某種代謝產(chǎn)物，就必須打破微生物原有的平衡狀態(tài)，這就需要對細胞的代謝途徑進行修飾。 ，應(yīng)用基因突變來改造微生物原有的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。由于該工程在很大程度上依賴于傳統(tǒng)的化學(xué)誘變技術(shù)及設(shè)計精巧的選擇程序，因此手段單一，結(jié)果不盡人意。 ，利用基因克隆改變代謝流，擴展和構(gòu)建新的代謝途徑，盡可能最大限度地提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率，已取得令人矚目的成果。 代謝工程的第一個應(yīng)用實例： 1974年 ， Chakrabarty在假單胞菌屬的惡臭假單胞菌 （ P. putide） 和銅綠假單胞菌 （ P. aeruginosa） 中分別引入幾個穩(wěn)定的重組質(zhì)粒 ， 增加了兩者對樟腦和萘的降解催化活性 。 這標志著代謝工程作為一門學(xué)科的誕生 。 代謝工程的一般定義： 通過某些特定生化反應(yīng)的修飾來定向改善細胞的特性或運用重組 DNA 技術(shù)來創(chuàng)造新的化合物 具體定義： 代謝工程是應(yīng)用重組 DNA技術(shù)和應(yīng)用分析生物學(xué)相關(guān)的遺傳學(xué)手段進行有精確目標的基因操作，以改變微生物原有的調(diào)節(jié)系統(tǒng)（酶的功能和輸送體系的功能、甚至產(chǎn)能系統(tǒng)的功能），通過有目的地對細胞代謝進行修飾（功利性修飾）以改變細胞某些方面的代謝活性的整套工作（包括代謝分析、代謝設(shè)計、遺傳操作、目的代謝獲悉功能的實現(xiàn)），從而達到實現(xiàn)目的代謝活性的提高這一預(yù)期目標的一個嶄新的領(lǐng)域。 研究手段： 代謝工程注重酶學(xué)、化學(xué)計量學(xué)、分子反應(yīng)動力學(xué)以及現(xiàn)代數(shù)學(xué)的理論及技術(shù)為研究手段，在細胞水平上闡明代謝途徑與代謝網(wǎng)絡(luò)之間局部與整體的關(guān)系、胞內(nèi)代謝過程與胞外物質(zhì)運輸之間的偶聯(lián)以及代謝流流向與控制的機制，并在此基礎(chǔ)上通過工程和工藝操作達到優(yōu)化細胞性能的目的。 代謝工程中的遺傳手段可以采用基因工程技術(shù)，也可以采用常規(guī)誘變育種技術(shù)，但前者有機會引進外源基因和外源調(diào)節(jié)因子，這同傳統(tǒng)的改良菌種的遺傳方法不同。 代謝工程通過對特定的生化反應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)進行修飾或用重組 DNA技術(shù)導(dǎo)入新的生化反應(yīng)來改進蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。 代謝工程的實質(zhì)： 對代謝流量及其控制進行定量分析的方法與用來實現(xiàn)預(yù)期的遺傳修飾的分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合 代謝工程所要解決的問題是什么呢？ 代謝工程要解決的主要問題： 改變某些途徑中的碳架物質(zhì)流量或改變碳架物質(zhì)流在不同途徑中的流量分布 典型目標是： 修飾初級或次級代謝，將碳架物質(zhì)流導(dǎo)入目的產(chǎn)物的理想載流途徑以獲得產(chǎn)物的最大轉(zhuǎn)化率 具體表現(xiàn)為： ① 提高細胞現(xiàn)存代謝途徑中目標產(chǎn)物的產(chǎn)量； ② 改造細胞現(xiàn)存代謝途徑 ，使其合成新產(chǎn)物 ， 這種新產(chǎn)物可以使中間代謝產(chǎn)物或修飾型的最終產(chǎn)物； ③ 對不同細胞的代謝途徑進行擬合 ，構(gòu)建全新的代謝通路 ， 從而產(chǎn)生細胞自身不能合成的新產(chǎn)物； ④ 優(yōu)化細胞的生物學(xué)特性 ， 如生長速率 、 某些極端環(huán)境條件的耐受性等 。 代謝工程的實質(zhì)： 對代謝網(wǎng)絡(luò)進行定量分析，并在此基礎(chǔ)上進行代謝改造（代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)），以最大限度地提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)率 代謝工程設(shè)計的主要內(nèi)容包括： ① 生物合成相關(guān)代謝調(diào)控 和代謝網(wǎng)絡(luò)理論； ② 代謝流的定量分析； ③ 代謝網(wǎng)絡(luò)的重新設(shè)計； ④ 中心代謝作用機理及相關(guān)代謝分析； ⑤ 基因操作 。 代謝工程關(guān)注的最多的 是代謝途徑的組合而非單一的反應(yīng)。完整的生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)就是代謝工程必須要考察的，重視代謝網(wǎng)絡(luò)和目標產(chǎn)物的熱力學(xué)可行性、代謝流及其控制。 代謝工程的精髓 在于其從傳統(tǒng)的單一酶促反應(yīng)分析向相互作用的生化反應(yīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，更強調(diào)了代謝網(wǎng)絡(luò)的概念，也只有這樣，生物體代謝活