chapter2核酸的結(jié)構(gòu)與功能-資料下載頁
2025-04-26 08:40本頁面
【正文】 作用時，可從溶液中 沉降 下來，其沉降速度與核酸的大小和密度有關(guān)。 ? 核酸是 兩性電解質(zhì) （含堿性基團(tuán)、磷酸基團(tuán)），因磷酸的酸性強(qiáng)，常表現(xiàn)酸性 。由于核酸分子在一定酸度的緩沖液中帶有電荷，因此可利用電泳進(jìn)行分離和研究其特性 ,最常用的是 凝膠電泳 。 96 核酸的紫外吸收特性 ? 核酸在 260 nm波長有最大吸收峰，是由 堿基的共軛雙鍵 決定的 ,常用作核酸的定性、定量分析。 1. DNA或 RNA的定量 OD260= 50μg/ml 雙鏈 DNA 37μg/ml 單鏈 DNA 40μg/ml RNA DNA純品 : OD260/OD280 = RNA純品 : OD260/OD280 = 97 DNA的紫外吸收光譜 1. 天然 DNA 2. 變性 DNA 3. 核苷酸總吸收值 220 240 260 280 波長（ nm） 光吸收 1 2 3 ? 核酸的紫外光吸收值常比其各核苷酸成分的 光吸收值之和少 20－ 60%，這是在有規(guī)律的雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基緊密地堆積在一起造成的 。 98 DNA的變性復(fù)性與分子雜交 （一） DNA的變性 (denaturation) 定義 ： 核酸雙螺旋的氫鍵斷裂（ 不涉及共價鍵的斷裂 ）、變成單鏈， 生物活性喪失 的過程。 變性因素：熱力、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、變性劑、射線、機(jī)械力等。 部分雙螺旋解開 無規(guī)則線團(tuán) 鏈內(nèi)堿基配對 DNA的變性過程 99 DNA變性的本質(zhì)是 雙鏈間氫鍵的斷裂 100 ? 變性后理化性質(zhì)變化： ? DNA溶液的粘度降低 ? 浮力密度增加 ? 旋光偏振光改變 ? 紫外吸收增加（ 增色效應(yīng) ） ? 生物活性喪失 ? 但 DNA的一級結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變 101 ?增色效應(yīng) ： DNA變性時其溶液 OD260增高的現(xiàn)象 。 102 ? 當(dāng) DNA的稀鹽溶液加熱到80~100℃ 時，雙螺旋結(jié)構(gòu)即發(fā)生解體，兩條鏈彼此分開，形成無規(guī)線團(tuán)。 ? 熔解溫度 （ Melting temperature, Tm） ： DNA熱變性過程中，紫外吸收達(dá)到最大值的一半時溶液的溫度稱為熔解溫度 （ Tm） 或解鏈溫度、變性溫度。 實(shí)驗(yàn)室常用的方法 —— 熱變性 80 90 100 100% 50% OD260 Tm 變性溫度范圍 ① ② ③ ℃ 103 影響 Tm值的因素 (2)DNA的性質(zhì)和組成 (1)溶液的離子強(qiáng)度 大腸桿菌 DNA在不同濃度 KCl溶液下的熔融溫度曲線 離子強(qiáng)度越高， Tm值越高 G≡C， 3個氫鍵，打開所需能量較 A=T大， GC%越高， Tm越高 104 核酸的均一性愈高的樣品，變性過程的溫度范圍愈小。 (3) DNA的均一程度 105 （二） DNA的復(fù)性 定義 在適當(dāng)條件下，變性 DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為 復(fù)性。 減色效應(yīng) DNA復(fù)性時，其溶液 OD260降低。 熱變性的 DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為 退火 (annealing) 。 106 核酸 的變性 和 復(fù)性 變性 （加熱） 復(fù)性 （緩慢冷卻） 變性 ： 在物理 、 化學(xué)因素影響下 ， DNA堿基對間的氫鍵斷裂 ， 雙螺旋解開 ，這是一個是躍變過程 ， 伴有 OD260增加 （ 增色效應(yīng) ）,DNA的功能喪失 。 復(fù)性 ：在一定條件下 ， 變性 DNA單鏈間堿基重新配對恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu) ， 伴有OD260減小 （ 減色效應(yīng) ）,DNA的功能恢復(fù) 。 107 （三）核酸分子雜交 (hybridization) 在 DNA變性后的復(fù)性過程中 ， 如果將不同種類的 DNA單鏈分子或 RNA分子放在同一溶液中 ，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關(guān)系 ， 在適宜的條件 （ 溫度及離子強(qiáng)度 ） 下 ， 就可以在不同的分子間形成 雜化雙鏈 (heteroduplex)。 這種雜化雙鏈可以在不同的 DNA與 DNA之間形成 ， 也可以在 DNA和 RNA分子間或者 RNA與RNA分子間形成 。 這種現(xiàn)象稱為 核酸分子雜交 。 108 變性 復(fù)性 復(fù)性 109 核酸分子雜交的應(yīng)用 研究 DNA分子中某一種基因的位置 鑒定兩種核酸分子間的序列相似性 檢測目的基因表達(dá)水平的高低 是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ) 110 Southern印跡法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 瓊脂糖電泳 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 與放射性標(biāo)記DNA探針雜交 放射自顯影 帶有 DNA片段的凝膠 凝膠 濾膜 用緩沖液轉(zhuǎn)移 DNA 吸附有 DNA片段的膜 111 核酸的顏色反應(yīng) （核酸中磷酸的反應(yīng)） Pi + (NH4)3MoO4 + Vc 鉬藍(lán)（藍(lán)色） （ RNA中核糖的反應(yīng)） RNA + 濃 HCl +苔黑酚 藍(lán)綠色 DNA + 二苯胺 + 濃 H2SO4 藍(lán)色物 100℃ 、 FeCl3 少量冰醋酸 112 復(fù)習(xí)題： 1. 概念 （ 1） DNA的一級結(jié)構(gòu) （ 2）核苷多磷酸 （ 3） DNA的二級結(jié)構(gòu) （ 4）核酸的變性 （ 5）增色效應(yīng) （ 6）核酸的復(fù)性 （ 7）減色效應(yīng) （ 8） Tm 2. 簡述 DNA右手雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的主要內(nèi)容。 3. 簡述 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素。 4. 簡述 tRNA的二級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。 5. 簡述真核生物 mRNA 3′端 polyA尾巴的作用。 6. 簡述分子雜交的概念及應(yīng)用。 7. DNA變性后哪些性質(zhì)發(fā)生改變？ 8. 簡述影響 Tm值的因素。
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1