【正文】 L草酸。2．白陶土3．，6二氯酚靛酚（每ml≡）：稱(chēng)取2，，放置過(guò)夜。臨用前過(guò)濾，用標(biāo)準(zhǔn)維生素C標(biāo)定其濃度。標(biāo)準(zhǔn)維生素C溶液（1ml ≡ ）：稱(chēng)取維生素C 25mg，溶于4％鹽酸25ml，再用蒸餾水稀釋到50ml。，加2％鹽酸1ml，用配制的2，6二氯酚靛酚滴定。然后將2，6二氯酚靛酚稀釋為每ml≡ 維生素C ，貯于棕色瓶中。（王魯華）實(shí)驗(yàn)十八 影響酶促反應(yīng)的因素一. 溫度對(duì)酶活性的影響 [原理]溫度對(duì)酶的活性有顯著影響。溫度降低，酶促反應(yīng)減弱或停止，溫度升高，反應(yīng)速度加快。當(dāng)上升至某一溫度時(shí)，酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值，此溫度稱(chēng)為酶的最適溫度。溫度繼續(xù)升高，反應(yīng)溫度反而迅速下降，至80℃時(shí)，酶活性幾乎完全喪失。本實(shí)驗(yàn)以唾液淀粉酶為例。唾液淀粉酶催化淀粉水解生成各種糊精和麥芽糖。（C6H10O5）n→（C6H10O5）m→C12H22O11 淀粉 糊精m〈n 麥芽糖 淀粉溶液屬膠體溶液，具有乳樣光澤，與碘反應(yīng)呈藍(lán)色。糊精根據(jù)分子大小，與碘反應(yīng)呈藍(lán)、紫、紅等不同的顏色。因此，可以用碘檢查淀粉是否水解及其水解程度，間接判斷淀粉酶是否存在及其活性大小。 [操作] 1．收集唾液：用少量蒸餾水漱口，收集唾液約2ml，用蒸餾水稀釋510倍（根據(jù)各人的酶活性而定）。取小漏斗一支，墊小塊脫脂棉，過(guò)濾稀釋唾液，濾液備用。 2．取試管兩支，各加稀釋唾液2 ml，一管直接加熱煮沸，另一管置冰浴中預(yù)冷5分鐘，放置備用。3． 另取試管4支，編號(hào)，按下表操作。步驟1234第1步10g/L淀粉20滴淀粉20滴淀粉20滴淀粉20滴第2步置于0～4 oC冰浴5分鐘置于37 oC水浴5分鐘第3步預(yù)冷唾液10滴預(yù)冷唾液10滴唾液10滴煮沸唾液10滴第4步搖勻置于0～4 oC冰浴10分鐘搖勻再置于37 oC水浴10分鐘第5步碘液2滴移置37 oC水浴10分鐘后再加碘液2滴碘液2滴碘液2滴 注意：加唾液后應(yīng)混勻各管。加碘液后搖勻，觀察并解釋結(jié)果。 [試劑] 1．10g/L淀粉液。 2．碘液：稱(chēng)取碘1克，碘化鉀2克，同溶于100ml蒸餾水中，貯于棕色瓶。二. 激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)酶活性的影響 [原理]酶的活性在某些物質(zhì)的作用下可以增高或降低，反能提高酶活性的物質(zhì)稱(chēng)為酶的激動(dòng)劑；凡能降低或抑制酶活性但并不使酶變性的物質(zhì)稱(chēng)為酶的抑制劑。以唾液淀粉酶為例，氯離子使酶活性增強(qiáng)，銅離子強(qiáng)烈抑制酶活性。 [操作] 。2. 取潔凈試管4支，編號(hào)，按下表操作。試劑（滴） 123410g/L淀粉液2020202010g/LnaCL210g/LCuSO4 210g/LNa2SO42蒸餾水 2稀釋唾液 10101010 將各管混勻，置37℃水浴中，取瓷比色盤(pán)一個(gè)，預(yù)先加一排碘液，各凹處加12滴。每間隔2分鐘從第1管吸取保溫液一滴，測(cè)碘反應(yīng)，直至第1管不與碘呈色（即淺棕色）時(shí)，向各管加碘液2滴，搖勻觀察并解釋結(jié)果。 [試劑] 1．10g/L淀粉液。 2．10g/LNaCL。 3．10g/LCuSO4 4．10g/LNa2SO4 5．碘液: 稱(chēng)取碘1克，碘化鉀2克，同溶于100ml蒸餾水中，貯于棕色瓶。三. pH對(duì)酶活性的影響 [原理] 環(huán)境的pH值顯著影響酶活性。pH值既影響酶蛋白也影響底物的解離度，從而改變酶與底物的結(jié)合和催化作用。在某一pH時(shí)，酶活性達(dá)最大值，這一PH稱(chēng)酶的最適PH，不同的酶最適pH不盡相同。以唾液淀粉酶為例，該酶最適pH為6．9，過(guò)酸過(guò)堿均可使酶活性顯著降低。判斷PH對(duì)酶活性的影響，可用底物即淀粉消失的快慢來(lái)衡量酶活性的高低，可用淀粉與碘的呈色反應(yīng)來(lái)判斷。 [操作] 。 ，編號(hào)，按下表加試劑。試劑 123磷酸鹽緩沖液（ml）2（）2（）2（）10g/L淀粉液（ml）222稀釋唾液（滴）101010將各管混勻，置37℃水浴中，取瓷比色盤(pán)一個(gè)，預(yù)先在各池分別加1滴稀碘液。每隔1分中從第2管吸取保溫液1滴，加到已有碘液的比色盤(pán)小池中，直至此管不與碘呈色（即淺棕色）時(shí)，向各管加碘液2滴，搖勻觀察并解釋結(jié)果。 [試劑]1．10g/L淀粉液。2，稀碘液。（同溫度對(duì)酶活性的影響）。3，磷酸鹽緩沖液： : : 1/15mol/ : 1/15mol/ （李素婷）實(shí)驗(yàn)二十一 胰島素和腎上腺素對(duì)血糖濃度的影響 [原理]人和動(dòng)物體內(nèi)，血糖濃度受各種激素調(diào)節(jié)而維持恒定，胰島素能降低血糖，其它很多激素則有升高血糖的作用，其中以腎上腺素作用較為迅速而明顯。胰島素通過(guò)（1）促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；（2）增加血糖去路（氧化供能，合成糖原等）， 減少血糖來(lái)源（糖原分解，糖異生等）等作用降低血塘。腎上腺素促進(jìn)肝糖原分解和糖異生而增高血糖。此實(shí)驗(yàn)主要是觀察家兔注射胰島素和腎上腺素前后的血糖濃度變化。 血糖的測(cè)定方法（鄰甲苯胺法）：葡萄糖在熱醋酸溶液中與鄰甲苯胺縮合，脫水生成藍(lán)色的醛亞胺（schiff堿），最大吸收峰在630nm,其顏色深淺與葡萄糖含量成正比。 [操作]一、取血和注射： 1．稱(chēng)量家兔體重并記錄。 2．剪去兔耳緣上的毛，用二甲苯棉球擦耳緣靜脈處，用粗針頭刺破。3000 轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。 3．取血后，將家兔分為兩組，按體重分別腹部皮下注射胰島素或腎上腺素注射。胰島素（1ml含40單位）：每公斤體重注射1單位。腎上腺素注射液（1﹕1000）：。記錄注射時(shí)間，之后每隔30分鐘由耳緣靜脈取血一次，共三次，分別放入離心管中，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。二、血糖的測(cè)定：取3只試管按下表操作試劑（ml）測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管血清（或血漿）葡萄糖應(yīng)用液蒸餾水 鄰甲苯胺試劑 333 混勻，沸水浴中煮沸12分鐘，取出后流水冷卻5分鐘。分光光度計(jì)波長(zhǎng)630nm，以空白管調(diào)零、比色。 [計(jì)算] 血糖（mmol/L）= 5 參考值： [注意事項(xiàng)] 1．加熱溫度、時(shí)間等應(yīng)嚴(yán)格掌握，否則會(huì)影響顯色強(qiáng)度。 2．鄰甲苯胺試劑中醋酸濃度很高，比色時(shí)切勿將比色液流入比色計(jì)內(nèi)。 3．高脂血標(biāo)本的終反應(yīng)偶見(jiàn)渾濁，充分混勻。 [臨床意義] 1．生理性高血糖：攝入高糖膳食后，或情緒緊張而引起腎上腺素分泌增加時(shí)。 2．病理性高血糖：主要見(jiàn)于糖尿病，另外見(jiàn)于甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、皮質(zhì)醇增多癥、肝硬化及慢性肝炎等。 3．生理行低血糖：饑餓和劇烈運(yùn)動(dòng)。 4．病理行低血糖：胰島β細(xì)胞瘤，垂體前葉、腎上腺皮質(zhì)或甲狀腺機(jī)能減退等。 [試劑] 1．鄰甲苯胺試劑:，溶于940ml冰醋酸中，加鄰甲苯胺60ml，放置24小時(shí)后使用。 2．12mmol/L苯甲酸溶液：，加熱助溶，冷卻后定溶為1L. 3．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液（100mmol/L）:無(wú)水葡萄糖80烤箱內(nèi)干燥至恒重，移至于干燥器內(nèi)保存），溶于12mmol/L苯甲酸溶液80ml中，再定溶至100ml. 4．葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（5mmol/L）:取標(biāo)準(zhǔn)貯存液50ml，加12mmol/L苯甲酸至100ml. 5．胰島素注射液： 6．腎上腺素注射液。 7．二甲苯。 （李素婷）實(shí)驗(yàn)二十二 血清脂蛋白瓊脂糖電泳 [原理] 瓊脂糖電泳與薄膜電泳的原理基本是一致的，它們的區(qū)別主要是電泳支持物的不同。瓊脂糖是從海洋植物瓊脂中提取出來(lái)的一種聚合鏈線狀分子，加水后可以制成具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 本次實(shí)驗(yàn)是用瓊脂糖為支持物分離血清脂蛋白。 血清中的脂類(lèi)物質(zhì)均與血清蛋白質(zhì)結(jié)合成水溶性的脂蛋白形式存在，各種脂蛋白中，所含的蛋白質(zhì)種類(lèi)和數(shù)量不同，脂蛋白顆粒大小亦不同，這些因素使它們?cè)陔妶?chǎng)中的移動(dòng)速度各異，因而可以通過(guò)電泳使不同的脂蛋白一一分開(kāi)。 樣品先經(jīng)脂類(lèi)染料染色，通電后脂蛋白在凝膠板上的移動(dòng)量可以肉眼觀察。區(qū)帶寬窄及染色深淺反映各種脂蛋白的量。 瓊脂糖電泳可將血清脂蛋白分出3條區(qū)帶(α脂蛋白、前β—脂蛋白和β脂蛋白)。 [操作] 1．預(yù)染血清：，混合后置37oC水浴染色30分鐘。然后每分鐘2000轉(zhuǎn)，離心約5分鐘。 2．制備瓊脂糖凝膠板：已配制的5g/L瓊脂糖凝膠于沸水浴中加熱融化。用吸管吸取凝膠溶液流注載玻片，每片約3ml。靜置約半小時(shí)后凝固(天熱時(shí)需延長(zhǎng)，可放冰箱數(shù)分鐘加速凝固)。 3．點(diǎn)加血清：在將要凝固的瓊脂糖凝膠板距一端約2cm處， 10mm的金屬棒，向下壓使之接觸載玻片，用吸鐵石將小棒吸出。以小片濾紙吸干小槽中水分，用毛細(xì)管或微量注射器吸取經(jīng)過(guò)預(yù)染的血清約15μl，注入凝膠板上的小槽內(nèi)。 4．電泳：將加過(guò)血清的凝膠板平行放于電泳槽中，樣品放于陰極一端。兩塊三層紗布于巴比妥緩沖液中浸濕，然后輕輕緊密貼在凝膠板兩端，紗布的另一端浸于電泳槽內(nèi)的巴比妥緩沖液中，接通電源， 電壓為100V，每片電流為3～4mA，約經(jīng)電泳45～55分鐘，即可見(jiàn)分離之色帶。[臨床意義] 1．正常人血清脂蛋白可出現(xiàn)3條區(qū)帶，從陰極到陽(yáng)極依次為β脂蛋白(最深)、前β蛋白(最淺)，α脂蛋白(比前β脂蛋白略深些)，在原點(diǎn)處應(yīng)無(wú)乳糜微粒。 2．如果前β脂蛋白比α蛋白深，結(jié)合血清甘油三酯明顯升高和膽固醇正常或略高，可以確定為Ⅳ型高脂蛋白血癥。 3．如果β脂蛋白區(qū)帶比正常血清明顯深染者，同時(shí)結(jié)合血清總膽固醇明顯增高，甘油三酯正常者為Ⅱa型，若結(jié)合血清總膽固醇增高而甘油三酯略高和β略深者為Ⅱb型。 4．如果β和前β—兩區(qū)帶分離不開(kāi)連在一起稱(chēng)“寬β區(qū)帶”結(jié)合血清甘油三酯和膽固醇均有所增高，可定為Ⅲ型。 5．如果原點(diǎn)出現(xiàn)乳廉微粒，β、前β均正常或減低，結(jié)合血清甘油三酯明顯升高，可定為Ⅰ型 [試劑] 1．巴比妥緩沖液():，、加水至1000ml。 ，、加水至1000ml。 2. 5g/L瓊脂糖凝膠：，加入巴比妥緩沖液()100ml，置沸水浴中溶解，分裝于試管中，冰箱保存。 3．固定液：冰醋酸5ml與75%乙醇95ml混合。 4．染色液：。 5．漂洗液：60%乙醇溶液。 （王文勇）南昌夜場(chǎng)招聘，重慶夜場(chǎng)招聘 P5eWypr1A3Mx61