【正文】 株莖尖部進(jìn)行防治。二、蟲害重要害蟲有菜蟲、蚜蟲、金龜子、苜蓿夜蛾，危害葉片和嫩莖。防治方法主要是人工捕捉，也可用敵敵畏1500倍液，敵殺死2000倍液噴霧滅殺，還可藥物拌種。、晾曬及儲(chǔ)存8月至9月中旬收獲，待苞片枯黃，果實(shí)下端莖部3～5cm干枯彎曲時(shí)及時(shí)采收。采用密植機(jī)械化收脫，不但節(jié)省大量人力，使人免遭扎刺痛苦，而且效率高，速度快，效果好。水飛薊籽粒如含水12%以上便可發(fā)生霉變現(xiàn)象，因此，必須及時(shí)晾曬，將籽粒曬干裝袋入庫保管。質(zhì)量以籽粒飽滿，色澤勻稱、無霉變、無雜質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，水飛薊公頃產(chǎn)量一般為1700～2000kg。 20世紀(jì)60～80年代末，以Wagner為代表的藥學(xué)工作者從水飛薊中分離提取出的有效成分稱為水飛薊素，是一類新型的具有C9取代基的黃酮類化合物，即以二氫黃酮醇和苯丙素類衍生物縮合而成的黃酮木脂素類，主要含水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧和水飛薊亭。1975年竹本常松等從水飛薊種子中除獲得了上述水飛薊賓等異構(gòu)體外，并獲得兩種新的黃酮醇木脂體。經(jīng)紅外，紫外及核磁共振等分析，確定它們的結(jié)構(gòu)分別為2，3脫氫水飛薊賓和2，3脫氫水飛薊亭。Bandopadhyay等曾從水飛薊種子中分離得天然脫氫水飛薊賓，即2，3脫氫水飛薊賓。1979年Merlini等分離得到異水飛薊賓，并且推測水飛薊賓和異水飛薊賓可能分別為兩個(gè)非對(duì)映體的混合物(C2，C3是同一結(jié)構(gòu)；C2′，C3′是反式結(jié)構(gòu))，它們成為治療肝膽疾病的主要有效成分。水飛薊素提取分離方法多采用有機(jī)溶媒滲漉和熱回流，結(jié)合國內(nèi)外報(bào)道綜合成下述方法： 一、醋酸乙酯法水飛薊種子粗粉500g，加汽油1000mL，加熱回流3h，提取3次，得脫油種子粗粉，水浴上減壓蒸干殘存汽油，用醋酸乙酯1000mL回流3h，提取4次，提取液加活性炭1g回流1h，濾過，濾液加水100mL，振搖，洗滌4～5次，減壓回收溶劑至干(如有油液應(yīng)傾去)，用90％乙醇200mL稍加溶解，用汽油80mL振搖洗滌4～5次，醇液減壓回收至干，加酯酸乙酯200mL溶解，過濾，濾液減壓回收至干得水飛薊素。二、乙醇法脫脂后的水飛薊種子粗粉，加入工業(yè)乙醇250mL，以后每次加200mL，加熱回流3次，合并乙醇液，回收乙醇得濃縮液，醋酸乙酯萃取液減壓回收至干，得淺黃色粉末，加3倍量石油醚放置24 h過濾，干燥，得水飛薊素。 三、采用“罐組成強(qiáng)制循環(huán)逆流提取”新工藝結(jié)合強(qiáng)制循環(huán)法和逆流法，將提取周期由滲漉法的3d，熱回流法的2d縮短到16h。經(jīng)極差分析，認(rèn)為影響收率的主要因素是液固比及循環(huán)時(shí)間，其次是循環(huán)速度。實(shí)驗(yàn)證明，最佳工藝條件是液固比為5∶1，循環(huán)速度8～12次/小時(shí)。 本項(xiàng)目采用“罐組成強(qiáng)制循環(huán)逆流提取”新工藝。一、測定水飛薊總量采用比色法稱取相當(dāng)于水飛薊素樣品，加甲醇溶解，作為供試品溶液。精密稱取70mg水飛薊賓對(duì)照品置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作對(duì)照品溶液。取供試品溶液、對(duì)照品溶液、甲醇各1mL置10mL棕色量瓶中，蓋塞，置(50177。1)℃加熱器中放置50min，冷卻后，甲醇稀釋至刻度。，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置30min后，在490nm處測定吸收度，得水飛薊素的含量。二、水飛薊素主要有效成分分離測定方法雙波長薄層色譜掃描法％CMC板上以氯仿丙酮甲酸(9∶2∶1)二次展開，對(duì)水飛薊賓及水溶性衍生物和制劑進(jìn)行分析，λS=288 nm,λR=430 nm。每1mL含水飛薊1 mg的無水乙醇溶液作對(duì)照品溶液，計(jì)算對(duì)照品和樣品的峰面積與濃度的關(guān)系，即得供試品中水飛薊賓的含量。羅淑榮等采用CS930對(duì)益肝靈片中活性成分水飛薊賓與水飛薊亭進(jìn)行了分離測定。以展開劑甲苯醋酸乙酯冰醋酸(2∶1∶)展開，揮盡溶劑后顯色(％二氯氧鋯的無水乙醇溶液)。λS=300 nm,λR=365 nm, 反射鋸齒掃描，由標(biāo)準(zhǔn)品水飛薊賓和水飛薊亭的斑點(diǎn)與供試品斑點(diǎn)的吸收峰面積與濃度之比求得供試品中水飛薊賓和水飛薊亭的含量。HPLC法Martinelli等采用HPLC法定量分析人體血漿和尿液中水飛薊賓的含量。色譜條件： Diol(150mm3mm，id)，流動(dòng)相(正己烷乙醇=70∶30)用120μl/L的85％的磷酸酸化，檢測波長214 nm，此方法未將水飛薊賓與異水飛薊賓分離測定。90年代初，Mascher等采用RpHPLC法對(duì)血漿中游離和結(jié)合的水飛薊賓和異水飛薊賓進(jìn)行分離測定。色譜條件：Nucleosil 1203 C18 (80 mm 4 mm id)， mol/L磷酸(1∶1)， mL/min, 檢測波長285 nm， min。此方法較適用于水飛薊素的藥代動(dòng)力學(xué)等的測定。Ricrling等采用柱切換電化學(xué)檢測的HPLC法和反相紫外檢測的HPLC技術(shù)將血漿中游離的總的水飛薊賓和異水飛薊賓進(jìn)行分離測定。內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為橙皮素(5，7，3′三羥基4′甲氧基黃烷酮，C16H14O6)。， min。本項(xiàng)目采用RpHPLC法對(duì)水飛薊素制劑中水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧和水飛薊亭進(jìn)行分離測定。色譜條件：柱ShimPack VPODS(150mm id 5μm)，流動(dòng)相甲醇與混合溶劑(水二氧六環(huán)=9∶1)按梯度洗脫，檢測波長288nm，柱溫40℃。樣品中水飛薊亭、水飛薊寧、水飛薊賓與異水飛薊賓的保留時(shí)間為8，10，23和27min。 收率=提取物質(zhì)量／原料質(zhì)量100％得率=提取物質(zhì)量含量／原料質(zhì)量100％一、先脫脂再提取取原料粗粉500g以6＃，共脫脂2次，過濾，濾液回收6＃溶劑油，殘?jiān)?000mL乙酸乙酯回流提取3次，、乙酸乙酯液合并濃縮，干燥，得產(chǎn)品(070801)，結(jié)果見表1。二、先提取再脫脂取原料粗粉500g以乙酸乙酯1000mL回流提取3次，、提取液回收乙酸乙酯后加入500mL6＃溶劑油提取3次，油相回收溶劑，殘余物濃縮，烘干，得產(chǎn)品(070802)。由于水飛薊素不溶于石油醚、汽油、氯仿等，但考慮到生產(chǎn)成本、安全因素，以6＃溶劑油較合適，氯仿與乙酸乙酯互溶，還在水中有一定溶解度，操作中易乳化，成本較高，毒性很大，不宜采用，因此選擇6＃溶劑油。可用于提取的溶劑有甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮，但甲醇毒性大，不宜采用，選用乙醇、乙酸乙酯，丙酮為提取溶劑，采用先脫脂、再提取的方式。一、乙醇提取取原料粗粉500g，以1000mL6＃溶劑油脫脂3次后的殘?jiān)?倍量(v／w)乙醇回流提取3次，每次2h，合并乙醇液，濃縮，干燥，得產(chǎn)品(070803)。二、乙酸乙酯提取取原料粗粉500g，以lO00mL6＃溶劑油脫脂3次后的殘?jiān)詌O00mL乙酸乙酯回流提取3次，每次2h，合并乙酸乙酯液濃縮，干燥，得產(chǎn)品(070804)。三、丙酮提取取原料粗粉500g以lO00mL6＃溶劑油脫脂3次，殘?jiān)?000、1500、1000mL丙酮回流3次，每次2h，合并丙酮液，濃縮，干燥，得產(chǎn)品 (070805)。我們設(shè)計(jì)了4組實(shí)驗(yàn)，將乙酸乙酯提取物(070804)制備了80g，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(1)將提取物20g以200mL90％乙醇加熱溶解，過濾，濾液以活性炭脫色后濃縮，析晶，母液濃縮再析晶、干燥，得結(jié)晶物(070806)。(2)取提取物20g，以100mL乙酸乙酯溶解后，以5％NaHCO。溶液等體積洗3次，有機(jī)相再以水洗至中性，濃縮、干燥，得產(chǎn)品(070807)。(3)取提取物20g，以5％NaHCO 溶液80mL溶解，再以等體積6 溶劑油萃取，碳水相再以1：1鹽酸酸化至pH值為3后，以等體積乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯相水洗至中性，濃縮，干燥，得產(chǎn)品 (070808)。(4)取提取物20g，以乙酸乙酯lOOmL溶解，加入硅膠柱，以氯仿一甲醇(96：4)洗脫，TLC檢查，合并同類項(xiàng)，濃縮，干燥，得產(chǎn)品(070809)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表51：表51樣品質(zhì)量（g）收率(%)含量(%)得率(%)070801070802070803070804070805070806070807070808070809說明：070801～070805為理論得率，070806—070809為實(shí)驗(yàn)得率。由表51可知，提取方式中以乙醇提取較好。最佳工藝方案為：乙醇提取后濃縮液脫脂，脫脂液再萃取出有效成分，再堿洗、水洗、濃縮至干得成品。由以上結(jié)果可知，在脫脂方式的選擇上以先脫脂再提取得率較高，可能是先脫脂去除了一些油脂類成分，再提取時(shí)有效成分較易滲出，去除了屏蔽作用，因此，以先脫脂再提取為好。實(shí)際生產(chǎn)中可先以壓榨方式去除油脂，再提取。3種提取溶劑中以乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)，提取物得率最高，而且3種溶劑的提取方式以乙酸乙酯用量最少，較易回收，物耗，能耗小，因此，選擇乙酸乙酯為提取劑。4種純化方式中，以乙酸乙酯溶解，堿液去雜質(zhì)方法得率最高，特別是在提取劑選擇為乙酸乙酯后，提取液經(jīng)濃縮后可以堿液萃取除雜，相比較其他3種純化方式，整個(gè)過程。不混人其他溶劑，易于操作，成本較低，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，水飛薊素最佳提取純化工藝為：以原料粗粉2倍量(v／w)的6＃溶劑油脫脂2次，每次2h，殘?jiān)?％的NaHCO 溶液等體積萃取3次，有機(jī)相以水洗至中性，濃縮干燥，得成品，％，％。 水飛薊果→篩選→壓榨除油脂→溶解提取→濃縮→萃取→堿洗→水洗→干燥→得成品→包裝→入庫： α淀粉酶 CaCl2↘↓↙NaCO3 酒母↘↙乳酸菌大米→浸泡→磨漿→調(diào)漿→液化→糖化→酒精發(fā)酵→液體深層醋酸發(fā)酵→壓濾→滅菌→配制→成品 ↑ ↑ 水飛薊皮乳酸菌種子①原料液化和糖化②酒精發(fā)酵向罐中接入醪液量10%的酒母，并添加酒母量2%的乳酸菌液及20%的生香酵母及水飛薊皮，進(jìn)行共同酒精發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為3～5d。③ 醋酸發(fā)酵接入醋酸菌種子液10%(體積分?jǐn)?shù))。：料液酸度2%，溫度33～35℃，發(fā)酵通風(fēng)比為1∶～，發(fā)酵時(shí)間為40～ 60h。④ 醋酸發(fā)酵后處理為了改善風(fēng)味，可用熏醅增香、增色。：工藝操作流程面粉、水飛薊餅渣 黃豆 泡豆 入鍋 濕蒸 出料 風(fēng)冷 水 接種種曲 制曲種曲機(jī) 出曲三角瓶種曲 拌鹽水菌種 發(fā)酵 抽油%麩皮，裝入預(yù)先洗滌、干燥、配好棉塞的250ml的三角瓶中。裝瓶厚度為1cm。 30分鐘℃，在無菌環(huán)境下接種，培養(yǎng)溫度為28—32℃，培養(yǎng)過程搖瓶兩次，首次在曲料發(fā)白結(jié)塊時(shí)進(jìn)行，相隔46小時(shí)曲料再次結(jié)塊時(shí)則進(jìn)行第二次搖瓶。，曲霉發(fā)育成熟即可使用，或存放在冰箱待用。：培養(yǎng)成熟的瓶種，菌絲發(fā)育粗壯，整齊、稠密，頂囊肥大, 孢子呈黃綠色，發(fā)芽率不低于90%，孢子數(shù)達(dá)90億個(gè)／克曲（干基）以上。，從蒸料、接種、培養(yǎng)都在此設(shè)備內(nèi)進(jìn)行無菌操作，用鋁盤內(nèi)裝約2厘米厚以麩皮為主，潤水后置入此設(shè)備中，上蓋密封后通入高壓蒸汽蒸熟，降溫時(shí)，種曲機(jī)內(nèi)從真空回到常壓的過程中將三角瓶菌種隨空氣吸入，附著料上，完成了接種。：熱量的排除靠種曲機(jī)夾層通冷水或溫水以及內(nèi)部風(fēng)扇進(jìn)行，并適時(shí)送入新鮮無菌空氣，供曲霉繁殖用。制曲時(shí)間為72小時(shí)。：孢子數(shù)：60億個(gè)/克曲（千基）：發(fā)芽率：90%以上；雜菌數(shù)：小于50個(gè)/克1. 大豆經(jīng)篩選除去其中的雜質(zhì)、鐵、粉塵。2 .大豆浸泡：準(zhǔn)確稱取已除雜除鐵的大豆放入泡豆罐中，按加水比1:，浸至豆粒膨脹無皺紋帶彈性，以兩指擠捏使皮肉分開， 將豆粒切開不發(fā)現(xiàn)干心時(shí)可視為適度。浸泡時(shí)間為47小時(shí)。出罐后的大豆晾至無水滴出后送入蒸料罐中。：將含水飛薊餅渣的物料送入蒸料罐中，蓋好罐蓋。啟動(dòng)蒸料罐，使其旋轉(zhuǎn)。2. 潤料：將準(zhǔn)確定量并加熱至工藝規(guī)定溫度的熱水泵入蒸料罐，按工藝規(guī)定時(shí)間進(jìn)行潤水40分鐘。3. 蒸料：（1） 開啟蒸汽閥，同時(shí)打開排汽閥，當(dāng)排汽管開始持續(xù)噴出蒸汽時(shí)關(guān)閉排氣閥，關(guān)閉蒸汽閥，打開排汽閥。（2）待壓力降至零位，關(guān)閉排汽閥同時(shí)打開蒸汽閥，－，然后關(guān)閉蒸汽閥，迅速打開排汽閥，使罐內(nèi)汽壓迅速降至常壓。4. 冷卻：打開冷凝噴射器，15分鐘內(nèi)將物料品溫降至工藝規(guī)定溫度，關(guān)閉冷凝噴射器，打開罐蓋，將物料倒出進(jìn)入落料斗。：感官：外觀呈黃褐色，有香氣及彈性，無夾心，無黏性及其他不良?xì)馕?。理化：消化率?5%，水分60%～62%，無N性蛋白。1. 接種：（1） 將制曲室、曲床及工用具清洗干凈，密閉曲室，按25g/㎡稱取硫磺點(diǎn)燃，滅菌24小時(shí)備用。（2） 先將物料和工藝規(guī)定數(shù)量的種曲充分均勻混合，再送至制曲室曲床內(nèi)。接種量：%；接種溫度：30177。2℃。： 將已接種的曲料均勻、疏散攤平，曲料厚度為25㎝左右，調(diào)節(jié)品溫于工藝規(guī)定的30℃左右，插入傳感器和溫度計(jì)，控制室溫于工藝規(guī)定溫度。：（1）間隔1小時(shí)，準(zhǔn)確測定并記錄曲料品溫及曲室室溫。（2）維持曲料品溫在工藝規(guī)定范圍內(nèi)，培養(yǎng)8小時(shí)，然后間斷性給曲料通風(fēng)。（3）再培養(yǎng)4小時(shí)左右，曲料結(jié)餅并呈白色，品溫達(dá)到36℃左右，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行第一次翻曲。翻曲后曲料應(yīng)疏松平整，且無塊狀。（4）繼續(xù)培養(yǎng)4－6小時(shí)，曲料出現(xiàn)