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農(nóng)業(yè)生物技術(shù)備課本-資料下載頁(yè)

2025-04-07 03:16本頁(yè)面
  

【正文】 60年)首創(chuàng)。用于分離單細(xì)胞無性系,研究其生理、生化、遺傳上的差異而設(shè)計(jì)的一種單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、原生質(zhì)體及融合產(chǎn)物的培養(yǎng)。該法的特點(diǎn)為:可以定點(diǎn)觀察;分離單細(xì)胞系容易;但培養(yǎng)細(xì)胞氣體交換不暢。平板培養(yǎng)的基本技術(shù):(1)單細(xì)胞懸浮液的制備 (2)懸浮細(xì)胞密度的調(diào)制平板培養(yǎng)要求最初細(xì)胞密度(即初始植板密度)為110 179?!?0010 179。 個(gè)/ml 。初始植板密度:?jiǎn)渭?xì)胞固體平板培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞懸浮液接種到瓊脂培養(yǎng)基上最初細(xì)胞密度。若懸浮液與培養(yǎng)基以1:4混合,則應(yīng)把懸浮液的細(xì)胞密度調(diào)到 510 179。 50010 179。 個(gè)/ml。(3)瓊脂培養(yǎng)基配制 % 瓊脂基本培養(yǎng)基+等量細(xì)胞培養(yǎng)液= % 瓊脂條件培養(yǎng)基。(4)平板制作細(xì)胞懸浮液與融化狀態(tài)(35 ℃ )條件培養(yǎng)基按一定比例均勻混合,倒成平板,蓋上培養(yǎng)皿蓋。用封口膜封嚴(yán)培養(yǎng)皿。(5) 培養(yǎng) 26℃置暗處培養(yǎng)21天。低倍顯微鏡觀察, 記數(shù)單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán),計(jì)算置板效率(也稱植板率)。三、影響單細(xì)胞培養(yǎng)的因子1.條件培養(yǎng)基條件培養(yǎng)基可有利于單細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂2.細(xì)胞密度臨界密度:?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)時(shí),初始植板密度低于某值培養(yǎng)細(xì)胞就不能進(jìn)行分裂和發(fā)育成細(xì)胞團(tuán),則該值就是臨界密度。初始植板密度應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)狀況而改變,培養(yǎng)基越復(fù)雜則植板細(xì)胞的臨界密度越低,反之則相反。一般要求每毫升在1000個(gè)細(xì)胞以上。3.生長(zhǎng)物質(zhì)生長(zhǎng)激素加1種細(xì)胞分裂素和幾種氨基酸。臨界密度只需2530細(xì)胞/毫升。4.pH5.CO2四、植物的再生分化類型無菌短枝姓 芽增殖性 器官發(fā)生型 胚狀體發(fā)生型 原球菌型第二節(jié),植物組織培養(yǎng)的設(shè)施設(shè)備一、設(shè)計(jì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)包括:洗滌室、配置室、無菌室、培養(yǎng)室、觀察室等。在實(shí)際中可結(jié)合可行條件,合并一部分。(一)洗滌室(cleaning room)洗滌室用于完成玻璃器皿等儀器的清洗、干燥和貯存。室內(nèi)應(yīng)配備大型水槽,最好是白瓷水槽。為防止碰壞玻璃器皿,可鋪墊橡膠。上下水道要暢通。備有塑料筐,用于運(yùn)輸培養(yǎng)器皿。備有干燥架,用于放置干燥涮凈的培養(yǎng)器皿。(二)準(zhǔn)備室(repairing room)準(zhǔn)備室要求明亮、通風(fēng)。在準(zhǔn)備室內(nèi)要完成培養(yǎng)基制備以及試管苗出瓶、清洗與整理工作。如果房間較多,可將準(zhǔn)備室分為洗滌室和配置室兩部分。洗滌室專門負(fù)責(zé)試管苗出瓶與培養(yǎng)器皿的清洗工作;配置室則負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。 (三)緩沖室進(jìn)入無菌室前要在緩沖室里換上經(jīng)過滅菌的衛(wèi)生服、拖鞋,戴上口罩。應(yīng)當(dāng)在此室內(nèi)安裝滅菌用的紫外燈??刂茻o菌室及培養(yǎng)室的配電板等。(四)無菌操作室(transfering room)接種室是進(jìn)行植物材料的分離接種及培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要操作室。其無菌條件的好壞對(duì)組織培養(yǎng)成功與否起重要作用。在工作方便的前提下,接種室宜小不宜大,一般7~8m2,要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑,易于清潔和消毒。配置拉動(dòng)門,以減少開關(guān)門時(shí)的空氣擾動(dòng)。接種室要求干爽安靜,清潔明亮。在適當(dāng)位置吊裝12盞紫外線滅菌燈,用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào),使室溫可控,這樣可使門窗緊閉,減少與外界空氣對(duì)流。 (五)培養(yǎng)室(culturing room) 培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長(zhǎng)的場(chǎng)所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜,周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架大多由金屬制成,一般 設(shè)5層,最低一層離地高約l0cm,其他每層間隔30cm左右。培養(yǎng)架長(zhǎng)度都是根據(jù)日光燈的長(zhǎng)度而設(shè)計(jì),如采用40W日光燈,30W的長(zhǎng)lm,寬度一般為60cm。培養(yǎng)室最重要的因子是溫度,一般保持在20~27℃左右,具備產(chǎn)熱裝置,并安裝窗式或立式空調(diào)機(jī)。由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度,最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。室內(nèi)濕度也要求恒定,相對(duì)濕度以保持在70%~80%為好,可安裝加濕器。控制日光照時(shí)間可安裝定時(shí)開關(guān)鐘,一般需要每天光照10~16h也有的需要連續(xù)照明。短日照植物需要短日照條件,長(zhǎng)日照 植物需要長(zhǎng)日照條件?,F(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室大多設(shè)計(jì)為采用天然太陽(yáng)光照作為主要能源,這樣不但可以節(jié)省能源,而且組培苗接受太陽(yáng)光生長(zhǎng)良好,馴化易成活。在陰雨天可用燈光作補(bǔ)充。(六)馴化室馴化室要求清潔無菌,配有空調(diào)機(jī)、加濕器、恒溫恒濕控制儀、噴霧器、光照調(diào)節(jié)裝置、通風(fēng)口以及必要的殺菌劑。(七)溫室應(yīng)配有空調(diào)機(jī)、通風(fēng)口、加濕器、恒溫恒濕控制裝置、噴霧裝置、光照調(diào)節(jié)裝置以及必要的殺菌殺蟲裝置及相應(yīng)藥劑。二、儀器設(shè)備和器皿用具(一)儀器設(shè)備(見實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì))1.超凈臺(tái),優(yōu)點(diǎn)是操作方便自如,比較舒適,工作效率高,準(zhǔn)備時(shí)間短。開機(jī)10分鐘即可操作,可進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間使用。在工廠化生產(chǎn)中,接種工作量很大,需要經(jīng)常長(zhǎng)久地工作時(shí),超凈臺(tái)是很理想的設(shè)備。超凈臺(tái)功率在145~260W左右,它裝有小型鼓風(fēng)機(jī),使空氣穿過一個(gè)前置過濾器,在這里把大部分空氣塵埃先過濾掉,然后再使空氣穿過一個(gè)細(xì)致的高效過濾器,、細(xì)菌和真菌孢子等,最后以較潔凈的氣流吹到工作臺(tái)面。超凈空氣的流速為每分鐘24~30m,這已足夠防止附近空氣襲擾而引起的污染,這樣的流速也不會(huì)妨礙采用酒精燈對(duì)器械等的灼燒消毒。在這樣的無菌條件下操作,就可以保證無菌材料在轉(zhuǎn)移接種過程中不受污染。超凈臺(tái)分水平式和垂直式二種型號(hào)。2.無菌箱,在投資少的情況下,可以用接種箱來代替超凈臺(tái)。接種箱依靠密閉、藥劑熏蒸和紫外燈照射來保證內(nèi)部空間無菌。但操作活動(dòng)受限制,準(zhǔn)備時(shí)間長(zhǎng),工作效率低。3.空調(diào)機(jī),保證室內(nèi)溫度,一般為25177。2℃,應(yīng)安置在室內(nèi)較高的位置。以便于排熱散涼。4.除濕機(jī),培養(yǎng)室的濕度應(yīng)為70~80%,濕度過高易長(zhǎng)雜菌,濕度過低培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)基會(huì)失水變干,影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。5.恒溫箱,用于植物材料的培養(yǎng),可以控制溫度、濕度及光照等。6.烘箱,用于干燥洗凈的玻璃器皿,也可用于干熱滅菌和測(cè)定干物重。用于干燥需保持80~100℃;進(jìn)行干熱滅菌需保持150℃,達(dá)1~3h;若測(cè)定干物重,則溫度應(yīng)控制在80℃烘干至完全干燥為止。7.高壓滅菌鍋,用于進(jìn)行培養(yǎng)基和器械用具的滅菌。小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室可選用小型手提式高壓滅菌鍋。如果是連續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn),應(yīng)選用大型立式的或臥式的高壓滅菌鍋。通常以電作能源。8.冰箱,主要用于貯存母液、各種易變質(zhì)、易分解的化學(xué)藥品以及植物材料等。9.電子分析天平和托盤天平,電子分析天平,用于稱取大量元素、微量元素、維生素;托盤天平用于稱取用量較大的糖和瓊脂等。天平應(yīng)放置在干燥、不受震動(dòng)的天平操作臺(tái)上。10.顯微鏡及解剖鏡,種類較多,用于分離微莖尖可采用雙筒實(shí)體解剖鏡。雙筒解剖鏡在分離莖尖等較小組織時(shí),便于觀察、操作,通常放大580倍。放大40倍以上操作需要有相當(dāng)熟練的技術(shù)和較好的工具。為進(jìn)行操作,要有照明裝置。解剖鏡上帶有照相裝置,根據(jù)需要隨時(shí)對(duì)所需材料進(jìn)行攝影記錄。11.水浴鍋,用于溶解難溶藥品和熔化瓊脂條12.搖床與轉(zhuǎn)床、用于改善液體培養(yǎng)材料的通氣狀況及促進(jìn)酶解原生質(zhì)體的解離。一般在液體培養(yǎng)中轉(zhuǎn)速為每分鐘100次左右,在解離原生質(zhì)體時(shí)為每分鐘80左右。13.磁力攪拌器,磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質(zhì),如各種化學(xué)物質(zhì)、瓊脂粉等。磁力攪拌器還可加熱,使之更利于溶解。14.電蒸餾水器,電蒸餾水器,采用硬質(zhì)玻璃或金屬制成。蒸餾水用于配制母液或培養(yǎng)基,配制培養(yǎng)基可用自來水來代替,若實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格的話,則須用蒸餾水。15.酸度計(jì),組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基pH值的準(zhǔn)確度是十分重要的,應(yīng)當(dāng)使用酸度計(jì),若無酸度計(jì),也可使用pH試紙進(jìn)行粗測(cè)。首次使用酸度計(jì)前,應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)節(jié)定位,然后固定。測(cè)量pH值時(shí),待測(cè)液必須充分?jǐn)嚢杈鶆?。如果培養(yǎng)基溫度過高,測(cè)量時(shí)要調(diào)整pH值計(jì)上的溫度扭使之和培養(yǎng)基溫度相當(dāng)。注意保護(hù)好玻璃電極,用后電極應(yīng)用蒸餾水沖洗凈,蓋上電極帽。1離心機(jī),用于收集原生質(zhì)體,轉(zhuǎn)速要求較低。一般為1000~4000rpm即可。(二)各類器皿1.培養(yǎng)器皿:在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基和進(jìn)行培養(yǎng)需大量的玻璃器皿。要求由堿性溶解度小的硬質(zhì)玻璃制成,以保證長(zhǎng)期貯存藥品及培養(yǎng)的效果;培養(yǎng)用的還要求透光度好,能耐高壓高溫,能方便放人培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的器皿,根據(jù)培養(yǎng)的目的和要求,可以采用不同種類、規(guī)格的玻璃器皿。其中以試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等使用較多。最常使用的是三角瓶,規(guī)格有l(wèi)00ml,250ml,500ml等,一般使用l00ml三角瓶,無論靜止或振蕩培養(yǎng)皆適用。其培養(yǎng)面積大,利于組織生長(zhǎng),受光也比試管好。由于瓶口較小,亦不易污染。培養(yǎng)皿常用12cm直徑等規(guī)格,要求上、下能密切吻合。這在游離細(xì)胞、原生質(zhì)體、花粉等的靜置培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、無菌種子的發(fā)芽、植物材料的分離等都需采用。 試管常用18mmXl80mm或20mmX200mm規(guī)格??捎糜谂囵B(yǎng)較高的試管苗,另外也不易污染。培養(yǎng)器皿還可就地取材,采用一些代用品。工廠化生產(chǎn)可采用廣口的200ml罐頭瓶,加蓋半透明的塑料蓋,由于瓶口大,所以大量繁殖時(shí)操作方便、工作效率高,也減少了培養(yǎng)材料的損傷。但缺點(diǎn)是易引起污染。目前,培養(yǎng)容器和制備培養(yǎng)基所需的玻璃器皿逐漸被塑料器皿所代替。塑料容器具有質(zhì)輕、透明、不易破碎、成本低等優(yōu)點(diǎn),如培養(yǎng)容器多為平底方盒形,可提高培養(yǎng)空間利用率的植株數(shù),并能一層層地疊摞起來,從而節(jié)約空間。這類塑料制品多是采用聚丙烯材料制成,能耐高溫,可進(jìn)行高壓滅菌。有些產(chǎn)品為一次性消耗品,不但可節(jié)省洗滌人工,還可節(jié)省時(shí)間,提高效率。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶,無須另外配蓋,使用時(shí)比較方便。瓶口封塞可用多種方法,要具有一定的通氣性和密閉性,以防止培養(yǎng)基干燥和雜菌污染。以前封口常用棉塞。但這種封口辦法夏季極易污染,且不易保持培養(yǎng)基的濕度?,F(xiàn)在多采用聚丙烯塑料薄膜作為封口,以線繩結(jié)扎或橡皮圈箍扎。為了增加通氣性,可在里面襯一層硫酸紙或牛皮紙。這樣經(jīng)濟(jì)方便,且通氣好。也可采用專用的封口膜。2.分注器,小型操作時(shí)可采用燒杯直接分裝。大型實(shí)驗(yàn)室可采用醫(yī)用“下口杯”作為分裝工具,在“下口杯”的下口管上套一段軟膠管,加一彈簧止水夾,使用時(shí)非常合適。更大規(guī)?;蛞蟾咝蕰r(shí),可考慮采用液體自動(dòng)定量灌注設(shè)備。3.離心管,用于離心收集原生質(zhì)體,一般用5ml、10ml規(guī)格。4.刻度移液管,、2ml、5ml、10ml。用于配制培養(yǎng)基時(shí)吸取不同種類的母液。應(yīng)多準(zhǔn)備幾支,分開使用。5.細(xì)菌過濾器,用于除去不能采用濕熱滅菌法的液體中的細(xì)菌。包括濾頭,注射器或采用抽濾裝置:真空泵、吸濾瓶、濾氣玻璃管等。6.實(shí)驗(yàn)器皿,在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基,貯藏母液,材料的消毒等需要各種化學(xué)實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿,包括100ml、250ml、500ml、1000ml燒杯;l0ml、l00ml、1000ml量筒;l00ml、1000ml試劑瓶(棕色)等等。(三)器械用具1.鑷子類(forceps)常應(yīng)用醫(yī)療上的鑷子。根據(jù)操作需要有各種類型,若用l00ml的三角瓶作為培養(yǎng)瓶,可用20em長(zhǎng)的鑷子。鑷子過短.容易使手接觸瓶口,造成污染。鑷子太長(zhǎng),使用起來不靈活。如在分離莖尖幼葉時(shí),則用鐘表鑷子。2.剪刀類(scissors)可采用醫(yī)療五官科用的中型剪刀。主要用于切斷莖段、葉片等。也可以用彎形剪刀,由于其頭部彎曲,可以深入到瓶口中進(jìn)行剪切。3.解剖刀切割較小材料和分離莖尖分生組織時(shí),可用解剖刀。刀片要經(jīng)常調(diào)換,使之保持鋒利狀態(tài),否則切割時(shí)會(huì)造成擠壓,引起周圍細(xì)胞組織大量死亡,影響培養(yǎng)效果。4.解剖針解剖針可深入到培養(yǎng)瓶中,轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織。也可用于分離微莖尖的幼葉,可以自制。 5.接種工具包括接種針、接種鉤及接種鏟,由白金絲或鎳絲制成6.鉆孔器用于取肉質(zhì)莖、塊莖、肉質(zhì)根內(nèi)部的組織時(shí)采用。一般為T字型??趶接懈鞣N規(guī)格。7.其它包括酒精燈,電爐,試管架,搪瓷盤等多種。第三節(jié) 培養(yǎng)基目的要求:(1)一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點(diǎn);(2)掌握基本培養(yǎng)基的配方;(3)一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量;(4)掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法和步驟;(5)熟練掌握培養(yǎng)基的滅菌方法;(6)一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法。培養(yǎng)基(culture medium)是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下,不同種植物的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)有不同的要求,甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也不相同,只有滿足了它們各自的特殊要求,它們才能很好地生長(zhǎng)。因此,沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官,在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí),首先必須找到一合適的培養(yǎng)基,培養(yǎng)才有可能成功。在植物組織培養(yǎng)歷史進(jìn)程中,事實(shí)上也緊密地伴隨著培養(yǎng)基的研制史。對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)要求的不斷認(rèn)識(shí),對(duì)已有培養(yǎng)基的改進(jìn),或者將新發(fā)現(xiàn)的植物激素、新的有益成分應(yīng)用于培養(yǎng)基之中,都大大促進(jìn)了組織培養(yǎng)研究的迅速發(fā)展,取得越來越多的成功。一、培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。1.水水是植物原生質(zhì)體的組成成分,也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動(dòng)過程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水,以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性,防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)39。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水,以防成分的變化引起不良效果。2.無機(jī)元素(inorganicelement)大量元素,指濃度大于0.5mmol/L的元素,有N,P,K,Ca,Mg,S等。其作用是: (1) N 是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分,是生命不可缺少的物質(zhì)。在制備培養(yǎng)基時(shí)以N03N和NH4N兩種形式供應(yīng)。大多數(shù)培養(yǎng)基既含有NO,N又含NH4N。NH4N對(duì)植物生長(zhǎng)較為有利。供應(yīng)的物質(zhì)有KN0NH4NO3等。有時(shí),也添加氨基酸來補(bǔ)充氮素。(2) P 是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生質(zhì)、細(xì)胞核的重要組成部分。磷也是ATP、ADP等的組成成分。在植物組織培養(yǎng)過程中,向培養(yǎng)基內(nèi)添加
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