【正文】 降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。（一）酶的金屬離子置換修飾1. 金屬離子置換修飾的方法 酶的分離純化除去原有的金屬離子：加入金屬螯合劑加入置換離子1. 金屬離子置換修飾的方法 p 金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中 本來(lái)含有金屬離子的酶 。p 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是 二價(jià)金屬離子 。 2. 金屬離子置換修飾的作用? 闡明金屬離子對(duì)酶催化作用的影響? 提高酶活力? 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性? 改變酶的動(dòng)力學(xué)特性(二 )大分子結(jié)合修飾? 定義： 利用 水溶性大分子與酶結(jié)合 ,使酶的空間 結(jié)構(gòu) 發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而 改變酶的特性與功能的 方法稱為大分子結(jié)合修飾法。簡(jiǎn)稱為大分子結(jié)合法。? 常用的修飾劑 ：右旋糖酐（ dextran）、聚乙二醇（ PEG）、肝素 (heparin)、蔗糖聚合物（ Ficoll）、聚氨基酸等。? 大分子結(jié)合修飾是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。? 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過(guò) 共價(jià)鍵 連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。? 例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶 ，不僅可以降低或消除酶的抗原性 ，而且提高了 抗蛋白酶的能力 ，延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的 半衰期 從而提高了酶藥效。共價(jià)修飾(二 )大分子結(jié)合修飾? 每分子核糖核酸酶與 合，可以使酶活力提高到原有酶活力的 倍；? 每分子胰凝乳蛋白酶與 11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的 共價(jià)修飾(二 )大分子結(jié)合修飾1. 大分子結(jié)合修飾的方法修飾劑的選擇 ：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（ PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（ Ficoll）、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化 ：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過(guò)活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。 1. 大分子結(jié)合修飾的方法修飾 ：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過(guò)分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、 pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。 分離 ：需要通過(guò)凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。 ? 聚乙二醇 是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無(wú)毒性、無(wú)殘留、無(wú)免疫原性，并 可消除酶的抗原性 ，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。1. 大分子結(jié)合修飾的方法2. 大分子結(jié)合修飾的作用? 提高酶活力? 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性? 降低或消除酶蛋白的抗原性修飾的作用通過(guò)修飾 提高酶活力 ：水溶性大分子通過(guò)共價(jià)鍵與酶分子結(jié)合后，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，使酶的活性中心更利于和底物結(jié)合，形成準(zhǔn)確催化部位。通過(guò)修飾增加 酶的穩(wěn)定性 ：酶的穩(wěn)定性用半衰期（指酶的活力降低到原來(lái)活力一半時(shí)所經(jīng)過(guò)的時(shí)間）表示。例如：? SOD能清除體內(nèi)的超氧負(fù)離子，受到醫(yī)藥界的極大關(guān)注。但是不容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在體內(nèi)的作用時(shí)間短等因素限制了 SOD的應(yīng)用。Beckman等利用 PEG修飾 SOD使其在血液中的半衰期由幾分鐘提高到數(shù)十小時(shí)，降低了抗原性，提高了對(duì)胰蛋白酶的消化抵抗功能。SOD大分子結(jié)合修飾酶 半衰期 相 對(duì)穩(wěn) 定性天然 SOD 6min 1 右旋糖 酐 SOD 7h 70Ficoll(聚蔗糖 ,低分子量 )–SOD14h 140Ficoll(高分子量 )–SOD24h 240聚乙二醇 SOD 35h 350通過(guò) 修飾降低或消除抗原 ：使抗體或抗原的特定結(jié)構(gòu)改變，則它們之間不再特異結(jié)合。例如：? ASNase（天冬酰胺酶）能專一地催化天門冬酰胺形成天門冬氨酸及氨，是治療白血病的有效藥物。在體內(nèi)作用時(shí)間短，反復(fù)注射會(huì)在血液中產(chǎn)生抗體，發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。用 PEG修飾修飾ASNase，其抗原性可完全消除。? 精氨酸酶經(jīng) PEG結(jié)合修飾后，其抗原性顯著降低。? 色氨酸酶經(jīng) PEG修飾后，完全消除該酶的抗原性。（三） 酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾? 定義： 采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法。? 可以用于研究各種基團(tuán)在酶分子中的作用及其對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。在研究酶的 活性中心中的必需基團(tuán) 時(shí)經(jīng)常采用。? 酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要包括 氨基、羧基、巰基、胍基、酚基 等。這些基團(tuán)可以形成各種副鍵，對(duì)酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。（三） 酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾催化活性 /非催化活性基團(tuán)的修飾? 對(duì)非催化基團(tuán)修飾可改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的束縛能力。 ? 經(jīng)常被修飾的殘基是： – 親核的 Ser、 Cys、 Met、 Thr、 Lys、 His– 親電的 Tyr、 Trp常用的化學(xué)修飾劑一、 氨基修飾劑 ：– 定義：凡能使酶蛋白側(cè)鏈上的氨基發(fā)生改變的化合物。– 原理：這類試劑作用于酶蛋白側(cè)鏈上的氨基或產(chǎn)生脫氨基，或與氨基共價(jià)結(jié)合將氨基屏蔽起來(lái)，使氨基原有的副鍵改變，從而改變酶蛋白的構(gòu)象。– 主要有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、亞硝酸、乙亞胺甲酯、 O甲基異脲、 順丁烯二酸酐 等。 氨基修飾反應(yīng)二、 羧基修飾劑 ：? 定義：可與酶蛋白側(cè)鏈上的羧基反應(yīng)的小分子化合物。? 原理：可使羧基 酯化、酰基化或結(jié)合 生成其他物質(zhì)，改變酶蛋白的空間構(gòu)象，從而改變酶的催化特性。? 主要有：乙醇 鹽酸試劑、水溶性的碳化二亞胺等。羧基修飾反應(yīng)碳二亞胺三、 巰基修飾劑 ：? 原理： 半胱氨酸殘基 側(cè)鏈中含有巰基。許多酶分子中存在的巰基通過(guò)形成二硫鍵維持蛋白質(zhì)分子的三維構(gòu)象，對(duì)維持酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起重要作用。? 常用試劑：巰基乙醇、二硫蘇糖醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉等。四、 胍基修飾劑 ：? 原理：精氨酸含有胍基。 二羰基化合物可與胍基縮合生成穩(wěn)定的雜環(huán)。? 主要有：環(huán)己二酮、乙二醛、苯乙二醛等精氨酸胍基修飾反應(yīng)五、 酚基修飾劑 ：? 原理： 酪氨酸殘基 上含有酚基。經(jīng)酚基修飾劑修飾后，酶分子由于 引入負(fù)電荷 ，增加了對(duì)帶正電荷底物的結(jié)合力，有利于酶催化功能的發(fā)揮。? 修飾酚基的方法有：碘化法、硝化法、琥珀?；ǖ?。? 主要有：四硝基甲烷 酚羥基修飾反應(yīng)六、咪唑基修飾反應(yīng)七、色氨酸吲哚基修飾反應(yīng)八、 分子內(nèi)交聯(lián)劑 ：? 原理：用含有雙功能團(tuán)的化合物，與酶分子內(nèi)兩個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)，在分子內(nèi)共價(jià)交聯(lián)，可使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定，從而也使酶的催化穩(wěn)定性增加。? 雙功能試劑 可以在酶分子中相距較近的兩個(gè)側(cè)鏈集團(tuán)之間形成共價(jià)交聯(lián)，從而提高酶的穩(wěn)定性。? 主要有：戊二醛、二氨基丁烷、已二胺等。（四） 酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾 )? 利用酶分子 主鏈的切斷和連接 ，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。? 酶蛋白主鏈修飾主要是靠 酶切 /酶原激活 法。a、胃蛋白酶原的激活 （四） 酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾 )b、胰蛋白酶原（ trypsinogen） 的激活 c、胰凝乳蛋白酶原（ chymotrypsinogen） 的激活 （五） 核苷酸鏈剪切修飾? 在核苷酸鏈的限定位點(diǎn)進(jìn)行剪切，使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變酶的特性和功能。（六） 氨基酸置換修飾酶蛋白是由各種氨基酸通過(guò)肽鍵聯(lián)結(jié)而成的。在特定位置上和各種氨基酸是酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。若將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，則會(huì)引起酶蛋白空間構(gòu)象的某些改變，從而改變酶的催化特性，這種修飾方法，稱為 氨基酸置換修飾 。例如：? 酪氨酰 tRNA合成酶 可催化酪氨酸和其所對(duì)應(yīng) tRNA，若將該酶第 51位的 蘇氨酸 由脯氨酸 置換，經(jīng)修飾后的酶對(duì) ATP的親和性提高近 100倍，酶活力提高 25倍；? T4溶菌酶分子中第 3位的 異亮氨酸 換成 半胱氨酸 后，該半胱氨酸可與第 97位的半胱氨酸形成 二硫鍵 ，氨基酸置換修飾后的 T4溶菌酶，其活力保持不變，但該酶對(duì) 熱的穩(wěn)定性卻大大提高 。? 提高酶活力? 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性? 改變酶的專一性置換修飾的作用（六） 氨基酸置換修飾? Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將 枯草桿菌蛋白酶 活性中心的 絲氨酸 轉(zhuǎn)換為 半胱氨酸 。? 修飾后，該酶 失去 對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻 出現(xiàn) 了催化硝基苯酯等底物水解的活性。? 但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。置換修飾的方法化學(xué)修飾法（六） 氨基酸置換修飾? 在 DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)置換修飾的方法定點(diǎn)突變技術(shù)（六） 氨基酸置換修飾（七） 核苷酸置換修飾? 將酶分子核苷酸鏈上的某一個(gè)核苷酸換成另一個(gè)核苷酸的方法。（八） 酶分子的物理修飾 ? 通過(guò)物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端 pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。? 特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的 共價(jià)鍵不發(fā)生改變 ，只是在物理因素的作用下， 副鍵發(fā)生某些變化和重排 。（九） 酶分子修飾的應(yīng)用? 酶學(xué)? 醫(yī)藥? 工業(yè)抗體酶研究開發(fā)? 核酸類酶人工改造? 有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)習(xí)題? 1.酶固定化技術(shù)對(duì)酶的性質(zhì)可能會(huì)產(chǎn)生哪些影響？? 2.酶分子修飾主要有哪些方法？修飾過(guò)程中應(yīng)注意哪些問(wèn)題？