【正文】 官方網(wǎng)站上下載（ 安裝工作就像安裝其他任何Windows 應(yīng)用程序一樣 ，本研究安裝 ActivePerl 版本 [75,76]。 檢測(cè) Perl 是否安裝成功，在 windows 操作系統(tǒng)下，命令行鍵入： perl v not PERL or Perl 如果 Perl 輸出它的版本號(hào) （見(jiàn)圖 ），那么就表示平臺(tái)已 安裝好 。 圖 Perl 版本界面圖 Fig. The interface of Perl version 13 BioPerl 模塊的安裝 BioPerl 是一組 Perl 語(yǔ)言的模塊，主要解決生物信息學(xué)中 Perl 編程的各種實(shí)際問(wèn)題，可用來(lái)獲取分子生物學(xué)數(shù)據(jù)，獲取及分析序列，序列比對(duì)，數(shù)據(jù)挖掘等 [77,78]。 可通過(guò) 訪問(wèn) BioPerl 的官方站點(diǎn)，該網(wǎng)站內(nèi)有大量的模塊和使用方法，可根據(jù)實(shí)際情況安 裝需要的模塊 。 （ 1） GUI 安裝 用 Perl Package Manager（如圖 ）可視安裝 Bioperl 模塊。它可以自動(dòng)下載所有模塊目錄，搜索 Bioperl 模塊，并安裝。 圖 Perl Package Manager 界面 The interface of GUI installation 14 （ 2） 命令行安裝 （圖 ） 在命令行中輸入： ppmshell search bioperl install 在這里輸入 bioperl 的版本號(hào)，且可以使用參數(shù)“ force”推進(jìn)安裝進(jìn)程。 圖 命令行安裝 界面 The interface of CommandLine installation 本地化序列比對(duì)系統(tǒng)的構(gòu)建 BLAST 的本地化 本地化 BLAST 軟件可直接從 NCBI（ 載。根據(jù)所用計(jì)算機(jī)操作系統(tǒng)，選擇與系統(tǒng)兼容的 BLAST 軟件，本研究下載的軟件與 windows 兼 容 [79]。該軟 件解壓后，會(huì)產(chǎn)生多個(gè)文件和文件夾，可得到 BLAST 的各種可執(zhí)行文件。其中 ， formatdb 是用來(lái)格式化 FASTA 格式的序列文件，將其按照BLAST 系統(tǒng)的要求建立數(shù)據(jù)庫(kù)， formatdb 程序的主要參數(shù)及含義見(jiàn)表 。以序列庫(kù)文件 為例，對(duì)其進(jìn)行格式化 , 在命令行鍵入： 15 formatdb i p F 表 Formatdb 程序的主要參數(shù) Table Some important parameters of formatdb 參數(shù) Parameter 含義 Meaning i 輸入文件 （ FASTA 格式的序列文件） p[T/F] T：創(chuàng)建蛋白數(shù)據(jù)庫(kù) F：創(chuàng)建核酸數(shù)據(jù)庫(kù) o[T/F] T：創(chuàng)建該序列的 ID 和索引 F：不創(chuàng)建 n 創(chuàng)建數(shù)據(jù)庫(kù)的名字（如不使用該參數(shù)，則默認(rèn)為輸入文件名） v 限制一卷的字符數(shù)（當(dāng)文件所含的字符數(shù)大 4G 時(shí) ， 設(shè)定 需將序列文件按給定大小分為多個(gè)卷 ， 每卷不超過(guò) 2G。 ） 表 blastall 程序主要參數(shù) Table Some important parameters of blastall 參數(shù) Parameter 含義 Meaning p 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索類(lèi)型（ blastn、 blastx、 blastp、 tblastn、 tblastx） i 輸入文件名 d 搜索的數(shù)據(jù)庫(kù) (已經(jīng) format 后的 ) e 序列間相似的閥值 m 比對(duì)的顯示方式（ 0~11 數(shù)字供擇） o 輸出文件名 BLAST 系統(tǒng)的使用 在 BLAST 軟件包中， blastall 是其核心程序，用命令行的方式運(yùn)行可以進(jìn)行大批量的序列分 析，這是本地化 BLAST 系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)所在 [80]。 blastall 程序包含一系列參數(shù)，參數(shù)詳情見(jiàn)表 。 blastall 中包 含 blastn， blastx， blastp， tblastn， tblastx 五個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序 [81]，用參數(shù)“ p”選擇，詳細(xì)功能見(jiàn)表 。在 命令行中輸入“ blastall”，則 16 會(huì)輸出 blastall 程序的開(kāi)發(fā)界面（見(jiàn)圖 ）。本研究只使用 blastn 程序，以核酸序列文件 為例，在命令行鍵入： blastall p blastn i d m 9 e 1E20 o 運(yùn)行結(jié)果會(huì)直接輸 入 文件中。 表 blastall 的 5 種數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序及功能 Table Five programs in blastall and their function 程序 Program 檢索序列 Query sequence 數(shù)據(jù)庫(kù) Database 功能 Function blastn 核苷酸 核苷酸 尋找高分值的匹配，適合于較關(guān)系 blastx 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì) 尋找較遠(yuǎn)關(guān)系的序列 blastp 核苷酸 蛋白質(zhì) 用于新的 DNA 和 EST 序列分析 tblastn 蛋白質(zhì) 核苷酸（翻譯） 尋找數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有表注的編碼區(qū) tblastx 核苷酸（翻譯） 核苷酸（翻譯） 用于分析 EST 序列 圖 blastall 程序的界面圖 The interface of blast system 17 SNP 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)系統(tǒng)的構(gòu)建 該系統(tǒng)是 以 新編寫(xiě)的 perl 程序作為控制程序，使 cross_match、 pharp、 eprimer3和 ePCR 四個(gè)程序自動(dòng)執(zhí)行。 序列拼接軟件的安裝及使用 （ 1） Swat/Cross_match/Phrap 軟件包 Swat/Cross_match/Phrap 軟件 包 可 以 通過(guò) 與相應(yīng)作者聯(lián)系獲得，有關(guān)信息查詢?cè)L問(wèn) web 站點(diǎn) ( 運(yùn)行環(huán)境為 RedHat Linux 10 操作系統(tǒng)，所有的 軟件在安裝時(shí)首先需要從壓縮包中釋放 (命令為 ： gzip d*， tar xfv*)出來(lái) ，然后進(jìn)入相應(yīng) 子目錄進(jìn)行編譯后即可使用。本研究只使用該軟件包中的 cross_match 和 phrap 兩個(gè)程序 （ 表 ） [82]，軟件中包 含了載體 序列庫(kù) Vector，該庫(kù)需隨時(shí)到 NCBI 上更新。 表 cross_match/phrap 程序功能及參數(shù) Table Function and parameters of cross_match/phrap program 程序 Program 功能 Function 參數(shù) Parameter 默認(rèn)值 Default cross_match 去除載體序列 minmatch 14 minscore 30 screen 載體標(biāo)示 phrap 對(duì)序列進(jìn)行拼接 minmatch 14 maxmatch 30 minscore 30 （ 2） cross_match 和 phrap 的使用 以文件 為例，使用 cross_match 和 phrap 程序 （ 文件中的序列必須為 FASTA 格式 ） 。 首先去除載體序列，在命令行鍵入： cross_match vector minmatch 10 minscore 20 screen 輸出文件為： ，用這個(gè)文件進(jìn) 行拼接，在命令行鍵入： phrap minmatch 20 maxmatch 40 minscore 20 18 運(yùn)行結(jié)果包括： contig 序列文件、 singlet 序列文件、 phrap 拼接文件、 SNP 質(zhì)量文件。 引物設(shè)計(jì)程序的安裝及使用 從 EMBOSS 的官方網(wǎng)點(diǎn) ( windows 操作系統(tǒng) 兼容的 embosswin 版 ，并安裝 。 本研究 只 使用該軟件中的 ePrimer3 程序 進(jìn)行引物設(shè)計(jì) [83]，其標(biāo)準(zhǔn) 參數(shù)見(jiàn)表 。 以 序列 文件 為例，使用 cross_match和 phrap 程序，在命令行鍵入： sequence productsizerange 1001500 outfile 運(yùn)行結(jié)果包括：引物的序列、 Tm 值、引物在模板上的結(jié)合位點(diǎn)、 PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度，默認(rèn) 5 對(duì)候選引物，一般使用第一對(duì)（最優(yōu)）引物。 也可 設(shè)置 numreturn 參數(shù) 為 1，直接輸出一對(duì)引物 。 表 eprimer3 程序標(biāo)準(zhǔn)參數(shù) Table Standard parameters of eprimer3 參數(shù) Parameter 含義 Meaning 默認(rèn)值 Default sequence 輸入序列（從 5′～ 3′ 端 ） 必須輸入 productsizerange 產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍 100300bp productosize 產(chǎn)物長(zhǎng)度 200bp numreturn 引物 對(duì) 數(shù) 5 minsize 引物堿基的最小值 18bp maxsize 引 物堿基的最大值 27bp outfile 引物輸出文件名 sequence.eprimer3 單一引物篩選程序的獲得及使用 本研究是用 ePCR程序 從 ePrimer3設(shè)計(jì)的引物中篩選能在 玉米模式自交系“ B73”基因組 BAC 文庫(kù)中 擴(kuò)增出單 一條帶的引物 [84]。該程 序可直接從 NCBI 網(wǎng)站上（ 下載，標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)見(jiàn)表 。 以 引物 文件 為例，使用 ePCR 程序， 作為引物擴(kuò)增的庫(kù)文件， 在命令行鍵入： 19 w 9 f 1 m 100 d=100400 n=1 g=1 t=3 運(yùn)行的結(jié)果包括： PCR 產(chǎn)物在基因組上的位置、方向及擴(kuò)出條帶的數(shù)量。 表 ePCR 程序標(biāo)準(zhǔn)參數(shù) Table Standard parameters of ePCR 參數(shù) Parameter 含義 Meaning 默認(rèn)值 Default d STS 默認(rèn)長(zhǎng)度范圍 w 字體大小 7 m 頁(yè)邊空白 50 n 錯(cuò)配最大值 0 g 缺失最大值 0 t 輸出格式（ 4 數(shù)字供擇） 必須輸入 o 輸出文件名 必須輸入 SNP 分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā) 原始數(shù)據(jù)來(lái)源 2022530 條 玉 米 EST 序 列 ， 2022 年 5 月 下載于 PlantGDB（ ； 125435 條玉米 CDS 序列 和 玉米模式自交系“ B73”基因組 BAC 文庫(kù) ， 2022 年 5月 下載于 Maize Sequence（ ； EST 序列前期處理 用 Swat/Cross_match/Phrap 軟件包 中的 Cross_Match 程序 去除 EST 序列上的載體序列，程序使用參數(shù) ： minmatch 10， minscore 20。 與 CDS 同源的 EST 序列 聚類(lèi) 將 2022530 條玉米 EST 序列文件 （ FASTA 格式） 作為比對(duì)的庫(kù)文件，并 BLAST軟件中的 formatdb 程序?qū)?kù)文件進(jìn)行格式化， 程序 使用參數(shù) ： p F。 20 用 CDS 序列逐一與玉米 EST 序列庫(kù)做同源比對(duì)，如 流程圖 所示 （圖 ） 。程序使用參數(shù) ： p blastn m 9 e 1E10。 用 Perl 程序提取與對(duì)應(yīng) CDS 序列 Identify 值大于90%、 alignment 值大于 mismatch 值小于 14 的 EST 序列，并以 FASTA 格式存放于一個(gè)文件中，用于下一步的分析 。 EST 序列拼接與 SNP 位點(diǎn)發(fā)掘 采 用 Swat/Cross_match/Phrap 軟件包 中的 phrap 程序 將 上一步得到 EST 序列 進(jìn)行拼 接 [85,86]，程序使用參數(shù)為： minmatch＝ 20， minscore＝ 20。用 Perl 程序， 屏蔽刪除 與 CDS 序列不同源的 contig 后，從 拼接詳細(xì)文件中調(diào)出組成各 contig 的所有 EST序列編號(hào)、 SNP 位點(diǎn)堿基突變的類(lèi)型及位置（圖 ）； 并保證 SNP 位點(diǎn)上的每種堿基類(lèi)型至少出現(xiàn)在 2 條 EST 序列上，分別存在兩條以上的序列支持該點(diǎn)突變各自的基因型。 圖 SNP 標(biāo)記開(kāi)發(fā)流程圖 Flow chart of developing SNP markers 21 保守序列的獲取及引物設(shè)計(jì) 將 玉米模式自交系 “ B73” 基因組 BAC 文庫(kù)序列 作為庫(kù)文件， contig 逐一與之進(jìn)行 本地化 BLSAT，從而將 contig 定位到玉米 BAC 文庫(kù) 上。 程序 使用參數(shù) ： p blastn m 1 e 1E40。 用 Perl 程序 獲取含 SNP 位點(diǎn)的保守序列 ,去除內(nèi)含子 區(qū)域 。 用 ePrimer3 程序，設(shè)計(jì)與 SNP 位點(diǎn)兩側(cè)保守序列互補(bǔ)的 PCR 引物（圖 ） ， 程序 使用參數(shù)： productsizerange 1002500。 圖 SNP 位點(diǎn)發(fā)掘與 PCR 引