生物化學(xué)第一章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能-資料下載頁
2025-01-16 14:01本頁面
【正文】 除變性因素后 ， 蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能 ， 稱為 復(fù)性 (renaturation) 。 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 β巰基乙醇 去除尿素、 β巰基乙醇 非折疊狀態(tài)，無活性 * 蛋白質(zhì)沉淀 在一定條件下 ， 蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外 ， 肽鏈融會(huì)相互纏繞繼而聚集 ， 因而從溶液中析出 。 變性的蛋白質(zhì)易于沉淀 ， 有時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀 ， 但并不變性 。 * 蛋白質(zhì)的凝固作用 (protein coagulation) 蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅(jiān)固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。 （四）蛋白質(zhì)的紫外吸收 由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸 ， 因此在 280nm波長處有特征性吸收峰 。 蛋白質(zhì)的 OD280與其濃度呈正比關(guān)系 ， 因此可作蛋白質(zhì)定量測定 。 （五）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng) ⒈ 茚三酮反應(yīng) (ninhydrin reaction) 蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的 氨基酸 也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。 ⒉ 雙縮脲反應(yīng) (biuret reaction) 蛋白質(zhì)和多肽分子中 肽鍵 在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為 雙縮脲反應(yīng) ，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。 二、蛋白質(zhì)的分離和純化 （一）透析及超濾法 * 透析 (dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。 * 超濾法 應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。 （二）丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀 *使用 丙酮沉淀 時(shí) ， 必須在 0～ 4℃ 低溫下進(jìn)行 ，丙酮用量一般 10倍于蛋白質(zhì)溶液體積 。 蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后 ， 應(yīng)立即分離 。 除了丙酮以外 ， 也可用乙醇沉淀 。 *鹽析 (salt precipitation)是將硫酸銨 、 硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液 ， 使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞 ， 導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀 。 * 免疫沉淀法： 將某一純化蛋白質(zhì)免疫動(dòng)物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識(shí)別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。 （三）電泳 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒 ， 在電場中能向正極或負(fù)極移動(dòng) 。 這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù) , 稱為 電泳 (elctrophoresis) 。 根據(jù)支撐物的不同 ， 可分為薄膜電泳 、 凝膠電泳等 。 幾種重要的蛋白質(zhì)電泳 *SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 ，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。 *等電聚焦電泳 ，通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。 *雙向凝膠電泳 是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。 PAGE 電泳結(jié)果 （四）層析 層析 (chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理 待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 。 主要的層析技術(shù)有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等。 蛋白質(zhì)分離常用的層析方法 * 離子交換層析： 利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。 * 凝膠過濾 (gel filtration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。 （五）超速離心 ultracentrifugation *既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量 。 *蛋白質(zhì)在離心場中的行為用 沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示 ,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān) 。 因?yàn)槌两迪禂?shù) S大體上和分子量成正比關(guān)系 ， 故可應(yīng)用超速離心法測定蛋白質(zhì)分子量 ， 但對分子形狀的高度不對稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用 。 三、多肽鏈中氨基酸序列分析 分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成 測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基 把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析 測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用 Edman降解法 一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。 通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列 按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列 分離編碼蛋白質(zhì)的基因 測定 DNA序列 排列出 mRNA序列 四、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定 * 二級(jí)結(jié)構(gòu)測定 通 常 采 用 圓 二 色 光 譜 (circular dichroism， CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量 。 ?螺旋的 CD峰有 222nm處的負(fù)峰 、208nm處的負(fù)峰和 198 nm處的正峰三個(gè)成分；而 ?折疊的 CD譜不很固定 。 * 三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 X射線衍射法 (Xray diffraction)和核磁共振技術(shù) (nuclear magic resonance, NMR)是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準(zhǔn)確的方法 。 * 用分子力學(xué) 、 分子動(dòng)力學(xué)的方法 ， 根據(jù)物理化學(xué)的基本原理 ， 從理論上計(jì)算蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu) 。 根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測其三維空間結(jié)構(gòu) * 通過對已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析 ， 找出一級(jí)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系 ， 總結(jié)出規(guī)律 ，用于新的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測 。
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