生物化學(xué)第01章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能臨床5年制第7版-資料下載頁
2025-01-16 13:39本頁面
【正文】 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一 pH時 ， 蛋白質(zhì)解離成正 、 負(fù)離子的趨勢相等 ， 即成為兼性離子 ， 凈電荷為零 ， 此時溶液的 pH稱為 蛋白質(zhì)的等電點 。 目錄 PHPI PH=PI PHPI 目錄 利用電荷性質(zhì)差異進(jìn)行蛋白質(zhì)分離 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒 ， 在電場中能向正極或負(fù)極移動 。 這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù) , 稱為 電泳 (elctrophoresis) 。 目錄 二、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子量 1萬至 100萬之間 ， 分子的直徑 1～ 100nm， 為膠粒范圍之內(nèi) 。 蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素 : 水化膜： 表面極性基團(tuán)吸附 H2O分子。 顆粒表面電荷： 靜電斥力， 使蛋白質(zhì)顆粒不易聚集。 目錄 + + + + + + + 帶正電荷的蛋白質(zhì) － － － － － － － － 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) 在等電點的蛋白質(zhì) 水化膜 + + + + + + + + 帶正電荷的蛋白質(zhì) － － － － － － － － 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) 不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒 酸 堿 酸 堿 酸 堿 脫水作用 脫水作用 脫水作用 溶液中蛋白質(zhì)的聚沉 目錄 蛋白質(zhì)沉淀： 蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)破壞，或疏水基團(tuán)暴露，使蛋白質(zhì)分子聚集，而從溶液中析出的現(xiàn)象。 使蛋白質(zhì)沉淀的因素： 中和電荷： pH=pI 破壞水化膜： 脫水劑 破壞空間結(jié)構(gòu)： 蛋白質(zhì)變性 結(jié)構(gòu)改變，疏水基團(tuán)暴露。 目錄 在物理和化學(xué)因素作用下， 蛋白質(zhì)特定 空間構(gòu)象被破壞 ， 即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其 理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性的喪失 。 蛋白質(zhì)變性 (denaturation) 三、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)破壞而引起變性 目錄 引起變性的因素： 加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等 變性的本質(zhì)： 破壞非共價鍵和二硫鍵， 不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。 變性的結(jié)果： 理化性質(zhì)改變： 溶解度降低，粘度提高。 生物學(xué)功能喪失， 稱為失活。 目錄 應(yīng)用舉例 : 使蛋白質(zhì)變性： 臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。 防止蛋白質(zhì)變性： 有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。 目錄 若蛋白質(zhì)變性程度較輕 ， 去除變性因素后 ， 蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能 ， 稱為 復(fù)性 。 蛋白質(zhì)的復(fù)性 (renaturation) 目錄 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 β巰基乙醇 去除尿素、 β巰基乙醇 非折疊狀態(tài)，無活性 目錄 變性的蛋白質(zhì)易于沉淀： 疏水側(cè)鏈暴露 ， 水化膜破壞 ， 調(diào)節(jié) pH， 蛋白質(zhì)容易從溶液中沉淀 。 沉淀的蛋白質(zhì)并不都變性 。 蛋白質(zhì)變性與沉淀 目錄 四、蛋白質(zhì) 在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰 由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在 280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的 OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。 目錄 蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。 蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為 雙縮脲反應(yīng) ，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。 五、應(yīng)用蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)可測定蛋白質(zhì)溶液含量 1. 茚三酮反應(yīng) (ninhydrin reaction) 2. 雙縮脲反應(yīng) (biuret reaction) 目錄 六、蛋白質(zhì)組學(xué) （一）蛋白質(zhì)組學(xué)基本概念 蛋白質(zhì)組 （ proteome): 是指一種細(xì)胞或一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，即“一個基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”。 蛋白表達(dá)譜 蛋白質(zhì)翻譯后修飾譜 目錄 （二）蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)平臺 蛋白質(zhì)組學(xué)是高通量，高效率的研究 : ?雙向電泳 分離樣品蛋白質(zhì) ?蛋白質(zhì)點的定位、切取 ?蛋白質(zhì)點的 質(zhì)譜分析 （三）蛋白質(zhì)組學(xué)研究的科學(xué)意義 反映蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能全貌。 比較蛋白質(zhì)組學(xué)，尋找疾病特異性蛋白質(zhì)分子。 目錄 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析 The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein 目錄 一、 透析及超濾法 : 清除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物。 二、 蛋白質(zhì)沉淀： 丙酮沉淀、鹽析、免疫沉淀 三、 電荷性質(zhì) : 電泳法 四、 相分配或親和結(jié)合 : 層析方法 五、 蛋白質(zhì)顆粒沉降 : 超速離心分離 目錄 六、應(yīng)用化學(xué)或反向遺傳學(xué)方法 分析多肽鏈氨基酸序列 分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成 測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基 把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析 測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用 Edman降解法 一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。 目錄 按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列 通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列 測定蛋白質(zhì)末端氨基酸序列 測定 cDNA序列 排列出 mRNA序列 根據(jù)末端氨基酸序列設(shè)計 RTPCR引物 RTPCR擴(kuò)增 cDNA 目錄 七、應(yīng)用物理學(xué)、生物信息學(xué)原理可進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定 二級結(jié)構(gòu)測定： 圓二色光譜 (circular dichroism， CD)： 測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量 。 ?螺旋的 CD峰： 222nm負(fù)峰 、 208nm負(fù)峰 、198nm正峰三個成分； 而 ?折疊的 CD譜不很固定 。 目錄 三級結(jié)構(gòu)測定： X射線衍射法 (Xray diffraction) 核磁共振技術(shù) (nuclear magic resonance, NMR) 是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準(zhǔn)確的方法 。 根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測其三維空間結(jié)構(gòu)： 幾十萬蛋白質(zhì)序列 7000蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)： X射線衍射法 、 NMR 目錄 ?同源模建 ： 待研究序列與已知結(jié)構(gòu)的 同源蛋白 進(jìn)行序列比對，通過模建和能量優(yōu)化計算，產(chǎn)生 待研究序列三維結(jié)構(gòu)。序列相似性越高，預(yù)測的模型也越準(zhǔn)確。 ?折疊識別 ： 通過預(yù)測二級結(jié)構(gòu)、預(yù)測折疊方式和參考其它蛋白的空間結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生 待研究 序列的三維結(jié)構(gòu)。 ?從無到有 ： 根據(jù)單個氨基酸形成二級結(jié)構(gòu)的傾向，加上各種作用力力場信息，直接產(chǎn)生 待研究 序列三維結(jié)構(gòu)。 根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測其三維空間結(jié)構(gòu)： 目錄 目的與要求 掌握： 氨基酸側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)特點；蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)形式和特點、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。 熟悉： 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系； 了解： 蛋白質(zhì)的分離、純化與序列分析技術(shù)。 （結(jié)合實驗課學(xué)習(xí)）
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