【正文】 將細(xì)胞懸液按所需數(shù)目種入鋪有生物基質(zhì)層的 培養(yǎng)器皿內(nèi)，于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每周換培養(yǎng)液 1次。 ④ 觀察并計(jì)數(shù)克隆之?dāng)?shù)目。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （ 3）膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 瓊脂層是一種簡(jiǎn)單的生長(zhǎng)基質(zhì)層，可幫助細(xì)胞貼附生長(zhǎng)。 但瓊脂中含有 酸性硫酸多糖 ，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞有一定的抑制作用。 然而，對(duì)于有些細(xì)胞，特別是病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞卻無(wú)大影響。 由于這些細(xì)胞易于懸浮培養(yǎng)，從而逐步發(fā)展了半固體培養(yǎng)基用來(lái)克隆懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的方法。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （ 4）瓊脂克隆法 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 1）瓊脂培養(yǎng)液的制備： ①用 Difco瓊脂配成 2％瓊脂母液，經(jīng)高壓 蒸汽消毒后貯存?zhèn)溆谩? ②準(zhǔn)備進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，將 2％瓊脂母液加熱融 化后，在室溫下降溫，然后浸人 45℃ 水 浴中。 ③將完全培養(yǎng)液也浸于 45℃ 水浴中溫育。 ④取完全培養(yǎng)液和 2%瓊脂液配成含有 % 瓊脂的培養(yǎng)液。分裝試管內(nèi)，每管加 ml 瓊脂培養(yǎng)液，仍浸于 45℃ 水浴 中，以保持瓊脂呈液化狀態(tài)。 2）消化、接種和培養(yǎng)待克隆細(xì)胞： ①將待克隆細(xì)胞用胰蛋白酶溶液消 化，用克隆培養(yǎng)液逐級(jí)稀釋細(xì)胞 懸液。 ②將稀釋后的細(xì)胞懸液浸于冰浴中。 在瓊脂試管內(nèi)各加入含有不同細(xì)胞 濃度的細(xì)胞懸液 ?；旌虾罅? 即傾入培養(yǎng)皿內(nèi)鋪平。 ③放置于 4℃ 條件下使其凝固。然后 置于 CO２ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 ④培養(yǎng) 1～ 2d觀察結(jié)果，計(jì)克隆數(shù)。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 克隆培養(yǎng)技術(shù) （ 4）瓊脂克隆法 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） ２、 影響克隆形成率的因素 接種眾多單個(gè)分散細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后能夠增生形成克隆的百分?jǐn)?shù)稱 克隆率 或 接種率 (cloning efficiency)，其高低與多種因素有關(guān)。 （ 1）接種的細(xì)胞密度 克隆形成率與接種細(xì)胞的密度有一定的相關(guān)性 (見下表 )，細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度越大，接種時(shí)每平方厘米培養(yǎng)皿上接種的細(xì)胞越多，克隆的形成率就越低。 為提高克隆形成率，須將細(xì)胞懸液稀釋成密度為 10個(gè)／ ml，甚至更低，接種的密度也要小。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） ２、 影響克隆形成率的因素 （ 1）接種的細(xì)胞密度 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 2）培養(yǎng)基 可用于克隆化的基礎(chǔ)培養(yǎng)液（見下表）。 通過(guò)選擇性培養(yǎng)，選定群落形成效率比較高的培養(yǎng)液作為最適的克隆化培養(yǎng)液。 其中 Ham培養(yǎng)液 和 F12K 培養(yǎng)液被證明是最好的克隆化培養(yǎng)液 ,適用于許多細(xì)胞類型。 克隆化培養(yǎng)液貯存時(shí)久會(huì)失去一些有活性的物質(zhì)如谷氨酰胺等，最好做到每 23d新鮮配制一批，并貯于 20℃ 。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 克隆化培養(yǎng)液 培養(yǎng)基名稱 應(yīng)用 培養(yǎng)基名稱 應(yīng)用 Eagle MEM Ham 培養(yǎng)液 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （ 2）培養(yǎng)基 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 3）血清 胎牛血清 作培養(yǎng)液中的血清成分，比 小牛血清 優(yōu)越。 用時(shí)可先做克隆形成率試驗(yàn)，選最佳者使用。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 4）飼養(yǎng)細(xì)胞 （ feeder cell） 在體外培養(yǎng)時(shí)，單個(gè)細(xì)胞和密度極低的分散細(xì)胞很難存活和增殖，使用飼養(yǎng)細(xì)胞有利于克隆的形成。 飼養(yǎng)細(xì)胞也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過(guò)射線照射傷害處理的、供其它細(xì)胞附著的細(xì)胞層。飼養(yǎng)細(xì)胞受射線照射后，失去分裂能力，但仍存活并有同化營(yíng)養(yǎng)液的能力，被作克隆的細(xì)胞散落在飼養(yǎng)細(xì)胞上層與之接觸后，飼養(yǎng)細(xì)胞能促進(jìn)克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞克隆形成后，飼養(yǎng)細(xì)胞漸死亡，換液時(shí)可被清除。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 5）激素和生長(zhǎng)因子 一些激素和生長(zhǎng)因子可促進(jìn)細(xì)胞克隆的形成。 例如，培養(yǎng)液中含 1～ 10 IU/ml的胰島素能促進(jìn)很多種細(xì)胞克隆的形成。地塞米松也能提高人正常膠質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞等的克隆形成率。表皮生長(zhǎng)因子可促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等生長(zhǎng)，推薦使用濃度為 1～ 20 ng／ ml。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 6） CO2 CO2對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞克隆形成率都有提高作用，常用 5％濃度。 對(duì)有的細(xì)胞，如 人成纖維細(xì)胞 和 膠質(zhì)細(xì)胞 克隆時(shí)， 2%的CO2效果可能更好。 HEPES ( 20 mmol/L）與 2%的 CO2配合使用能保護(hù)細(xì)胞免受培養(yǎng)液 pH值波動(dòng)的影響。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 7）適應(yīng)性生長(zhǎng)基質(zhì) 不同細(xì)胞適于在不同的生長(zhǎng)基質(zhì)上生長(zhǎng)。 例如，無(wú)限細(xì)胞系易貼附于塑料瓶壁上，原代培養(yǎng)的細(xì)胞易貼附于膠原層或血漿纖維蛋白層生長(zhǎng)基質(zhì)上。 有人證明，用多聚右旋賴氨酸（ polyDlysine）包被培養(yǎng)瓶、皿底壁后，能提高用低血清培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞克隆形成率。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） （ 7）適應(yīng)性生長(zhǎng)基質(zhì) 不同細(xì)胞適于在不同的生長(zhǎng)基質(zhì)上生長(zhǎng)。 另一種簡(jiǎn)單的生長(zhǎng)基質(zhì)層是 瓊脂層 ，常用濃度為 2%。 瓊脂層制備后，可把細(xì)胞接種在瓊脂層上。 瓊脂對(duì)一些病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和惡性細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)大影響。實(shí)驗(yàn)證明，惡變細(xì)胞或惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞在軟瓊脂（ %）中的生長(zhǎng)與在裸鼠體上的致瘤性有很大一致性。因此測(cè)試細(xì)胞能否在軟瓊脂中生長(zhǎng)，已成為測(cè)試轉(zhuǎn)化細(xì)胞惡性的重要指標(biāo)。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 克隆的分離 細(xì)胞克隆形成后，須將克隆分離出來(lái)并進(jìn)行繁殖。 常用的方法有三種： （ 1）克隆化環(huán)分離法： 在克隆過(guò)程中，形成的細(xì)胞群落在培養(yǎng)皿上分布不均一，而且群落和群落間沒(méi)有天然界限。因此，必須人為地給細(xì)胞群落創(chuàng)建一個(gè)隔離環(huán)境，便于進(jìn)一步分離。 克隆化環(huán)就是一種可用來(lái)隔離克隆的工具。瓷環(huán)、厚壁不銹鋼環(huán)、尼龍或特氟隆塑料環(huán)等都可用作克隆化環(huán)。克隆環(huán)基底必須是光滑的，內(nèi)徑要恰巧將一整個(gè)克隆圈進(jìn)，而不碰到鄰近克隆。 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） 克隆的分離 （ 2）射線照射分離法： 將所需的克隆用鉛板保護(hù)，其余細(xì)胞用 X射線或鈷 60源照射處理。 （ 3）半固體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)細(xì)胞克隆分離法： （略） 五、細(xì)胞系（株）和細(xì)胞克隆 細(xì)胞克隆形成后，須將克隆分離出來(lái)并進(jìn)行繁殖。 常用的方法有三種： （二）細(xì)胞克隆 （ cell cloning） OVE