【正文】 將細胞懸液按所需數(shù)目種入鋪有生物基質(zhì)層的 培養(yǎng)器皿內(nèi)，于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每周換培養(yǎng)液 1次。 ④ 觀察并計數(shù)克隆之數(shù)目。 五、細胞系（株）和細胞克隆 克隆培養(yǎng)技術 （ 3）膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法 （二）細胞克隆 （ cell cloning） 瓊脂層是一種簡單的生長基質(zhì)層，可幫助細胞貼附生長。 但瓊脂中含有 酸性硫酸多糖 ，對大多數(shù)細胞有一定的抑制作用。 然而，對于有些細胞，特別是病毒轉(zhuǎn)化細胞以及惡性轉(zhuǎn)化細胞卻無大影響。 由于這些細胞易于懸浮培養(yǎng)，從而逐步發(fā)展了半固體培養(yǎng)基用來克隆懸浮培養(yǎng)細胞的方法。 五、細胞系（株）和細胞克隆 克隆培養(yǎng)技術 （ 4）瓊脂克隆法 （二）細胞克隆 （ cell cloning） 1）瓊脂培養(yǎng)液的制備： ①用 Difco瓊脂配成 2％瓊脂母液，經(jīng)高壓 蒸汽消毒后貯存?zhèn)溆谩? ②準備進行培養(yǎng)時，將 2％瓊脂母液加熱融 化后，在室溫下降溫，然后浸人 45℃ 水 浴中。 ③將完全培養(yǎng)液也浸于 45℃ 水浴中溫育。 ④取完全培養(yǎng)液和 2%瓊脂液配成含有 % 瓊脂的培養(yǎng)液。分裝試管內(nèi)，每管加 ml 瓊脂培養(yǎng)液，仍浸于 45℃ 水浴 中，以保持瓊脂呈液化狀態(tài)。 2）消化、接種和培養(yǎng)待克隆細胞： ①將待克隆細胞用胰蛋白酶溶液消 化，用克隆培養(yǎng)液逐級稀釋細胞 懸液。 ②將稀釋后的細胞懸液浸于冰浴中。 在瓊脂試管內(nèi)各加入含有不同細胞 濃度的細胞懸液 ?；旌虾罅? 即傾入培養(yǎng)皿內(nèi)鋪平。 ③放置于 4℃ 條件下使其凝固。然后 置于 CO２ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 ④培養(yǎng) 1～ 2d觀察結果，計克隆數(shù)。 五、細胞系（株）和細胞克隆 克隆培養(yǎng)技術 （ 4）瓊脂克隆法 （二）細胞克隆 （ cell cloning） ２、 影響克隆形成率的因素 接種眾多單個分散細胞，經(jīng)培養(yǎng)后能夠增生形成克隆的百分數(shù)稱 克隆率 或 接種率 (cloning efficiency)，其高低與多種因素有關。 （ 1）接種的細胞密度 克隆形成率與接種細胞的密度有一定的相關性 (見下表 )，細胞懸液的細胞密度越大，接種時每平方厘米培養(yǎng)皿上接種的細胞越多，克隆的形成率就越低。 為提高克隆形成率，須將細胞懸液稀釋成密度為 10個／ ml，甚至更低，接種的密度也要小。 五、細胞系（株）和細胞克隆 （二）細胞克隆 （ cell cloning） ２、 影響克隆形成率的因素 （ 1）接種的細胞密度 五、細胞系（株）和細胞克隆 （二）細胞克隆 （ cell cloning） （ 2）培養(yǎng)基 可用于克隆化的基礎培養(yǎng)液（見下表）。 通過選擇性培養(yǎng)，選定群落形成效率比較高的培養(yǎng)液作為最適的克隆化培養(yǎng)液。 其中 Ham培養(yǎng)液 和 F12K 培養(yǎng)液被證明是最好的克隆化培養(yǎng)液 ,適用于許多細胞類型。 克隆化培養(yǎng)液貯存時久會失去一些有活性的物質(zhì)如谷氨酰胺等，最好做到每 23d新鮮配制一批，并貯于 20℃ 。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細胞系（株）和細胞克隆 （二）細胞克隆 （ cell cloning） 克隆化培養(yǎng)液 培養(yǎng)基名稱 應用 培養(yǎng)基名稱 應用 Eagle MEM Ham 培養(yǎng)液 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細胞系（株）和細胞克隆 （ 2）培養(yǎng)基 （二）細胞克隆 （ cell cloning） （ 3）血清 胎牛血清 作培養(yǎng)液中的血清成分，比 小牛血清 優(yōu)越。 用時可先做克隆形成率試驗，選最佳者使用。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細胞系（株）和細胞克隆 （二）細胞克隆 （ cell cloning） （ 4）飼養(yǎng)細胞 （ feeder cell） 在體外培養(yǎng)時，單個細胞和密度極低的分散細胞很難存活和增殖，使用飼養(yǎng)細胞有利于克隆的形成。 飼養(yǎng)細胞也稱滋養(yǎng)細胞，是一層經(jīng)過射線照射傷害處理的、供其它細胞附著的細胞層。飼養(yǎng)細胞受射線照射后，失去分裂能力，但仍存活并有同化營養(yǎng)液的能力，被作克隆的細胞散落在飼養(yǎng)細胞上層與之接觸后，飼養(yǎng)細胞能促進克隆細胞的生長。細胞克隆形成后，飼養(yǎng)細胞漸死亡，換液時可被清除。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細胞系（株）和細胞克隆 （二）細胞克隆 （ cell cloning） （ 5）激素和生長因子 一些激素和生長因子可促進細胞克隆的形成。 例如，培養(yǎng)液中含 1～ 10 IU/ml的胰島素能促進很多種細胞克隆的形成。地塞米松也能提高人正常膠質(zhì)細胞、膠質(zhì)瘤細胞、成纖維細胞、黑色素瘤細胞等的克隆形成率。表皮生長因子可促進角質(zhì)細胞、成纖維細胞和軟骨細胞等生長，推薦使用濃度為 1～ 20 ng／ ml。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細胞系（株）和細胞克隆 （二）細胞克隆 （ cell cloning） （ 6） CO2 CO2對絕大多數(shù)細胞克隆形成率都有提高作用，常用 5％濃度。 對有的細胞，如 人成纖維細胞 和 膠質(zhì)細胞 克隆時， 2%的CO2效果可能更好。 HEPES ( 20 mmol/L）與 2%的 CO2配合使用能保護細胞免受培養(yǎng)液 pH值波動的影響。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細胞系（株）和細胞克隆 （二）細胞克隆 （ cell cloning） （ 7）適應性生長基質(zhì) 不同細胞適于在不同的生長基質(zhì)上生長。 例如，無限細胞系易貼附于塑料瓶壁上，原代培養(yǎng)的細胞易貼附于膠原層或血漿纖維蛋白層生長基質(zhì)上。 有人證明，用多聚右旋賴氨酸（ polyDlysine）包被培養(yǎng)瓶、皿底壁后，能提高用低血清培養(yǎng)的人成纖維細胞克隆形成率。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細胞系（株）和細胞克隆 （二）細胞克隆 （ cell cloning） （ 7）適應性生長基質(zhì) 不同細胞適于在不同的生長基質(zhì)上生長。 另一種簡單的生長基質(zhì)層是 瓊脂層 ，常用濃度為 2%。 瓊脂層制備后，可把細胞接種在瓊脂層上。 瓊脂對一些病毒轉(zhuǎn)化的細胞和惡性細胞生長無大影響。實驗證明，惡變細胞或惡性轉(zhuǎn)化細胞在軟瓊脂（ %）中的生長與在裸鼠體上的致瘤性有很大一致性。因此測試細胞能否在軟瓊脂中生長，已成為測試轉(zhuǎn)化細胞惡性的重要指標。 ２、 影響克隆形成率的因素 五、細胞系（株）和細胞克隆 （二）細胞克隆 （ cell cloning） 克隆的分離 細胞克隆形成后，須將克隆分離出來并進行繁殖。 常用的方法有三種： （ 1）克隆化環(huán)分離法： 在克隆過程中，形成的細胞群落在培養(yǎng)皿上分布不均一，而且群落和群落間沒有天然界限。因此，必須人為地給細胞群落創(chuàng)建一個隔離環(huán)境，便于進一步分離。 克隆化環(huán)就是一種可用來隔離克隆的工具。瓷環(huán)、厚壁不銹鋼環(huán)、尼龍或特氟隆塑料環(huán)等都可用作克隆化環(huán)?？寺…h(huán)基底必須是光滑的，內(nèi)徑要恰巧將一整個克隆圈進，而不碰到鄰近克隆。 五、細胞系（株）和細胞克隆 （二）細胞克隆 （ cell cloning） 克隆的分離 （ 2）射線照射分離法： 將所需的克隆用鉛板保護，其余細胞用 X射線或鈷 60源照射處理。 （ 3）半固體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)細胞克隆分離法： （略） 五、細胞系（株）和細胞克隆 細胞克隆形成后，須將克隆分離出來并進行繁殖。 常用的方法有三種： （二）細胞克隆 （ cell cloning） OVE