【正文】 形成介質(zhì) 的 一般原則 是： ①所形成溶液的密度應(yīng)包括所需要的密度范圍； ②形成的溶液黏度較低； ③具有某些性質(zhì)如折射率，據(jù)此可測定它的濃度（或密度）； ④不損傷細(xì)胞或不改變細(xì)胞的生物學(xué)特性； ⑤離心分離后易于除去； ⑥不妨礙分離組分的分析。 按照上述原則來選擇，分離細(xì)胞常用的 密度梯度形成介質(zhì) 有： （ 1） 牛血清白蛋白 （ bovine serum albumin， BSA) （ 2） 聚蔗糖 （ polysucrose） （ 3） 泛影酸鹽 （ Diatrizoate） （ 4） 硅膠顆粒 （ 1） 牛血清白蛋白（ bovine serum albumin， BSA) 由于 BSA是血清蛋白，它對細(xì)胞活性的影響很小，是早期應(yīng)用連續(xù)或不連續(xù)密度梯度分離細(xì)胞的最常用介質(zhì)，但 BSA黏度很高，分離細(xì)胞必須長時(shí)間離心，且用量大，費(fèi)用高，故現(xiàn)在已經(jīng)部分被其它分離介質(zhì)取代。 （ 2） 聚蔗糖（ polysucrose） 是一種合成的蔗糖聚合物， 商品名 叫 Ficoll,常用的是： Mr400 000 Pa,名為 Ficoll 400。 Ficoll不滲入生物膜，滲透壓也很小，不影響細(xì)胞活性和酶活性，但其滲透毒性有隨濃度成指數(shù)增加的趨勢，且高濃度 Ficoll溶液的黏度大，可導(dǎo)致細(xì)胞凝集，故常以低濃度 Ficoll和其它物質(zhì)如泛影酸鹽合用以增加溶液的密度。 Ficoll 400是目前常用的細(xì)胞分離介質(zhì)之一，商品含量為 40％（ w／ V），也可用 Ficoll干粉來配制。 （ 3） 泛影酸鹽 泛影酸鹽 離子強(qiáng)度低，可配制成高密度而低滲透毒性的溶液，而且黏度比 Ficoll小，很適合密度梯度分離細(xì)胞，常與 Ficoll配合使用。 國外常用商品 Isopaque或稱 Triasil (sodium metrizoate)和Hypaque (sodium diatrizoate），與 Ficoll配制的溶液商品名為FicollIsopaque(Triosil)或 FicollHypaque，泛影酸鹽價(jià)格較貴。 國內(nèi)常用造影劑泛影葡胺（ meglumini diatrizoici）代替，其商品名為 Urografin,含量通常為 60%或 75%,其與 Ficoll配制的溶液商品名是淋巴細(xì)胞分離液（上海試劑二廠），密度 ，主要用于人單個(gè)核細(xì)胞的分離。 （ 4） 硅膠顆粒 用 聚乙烯毗咯烷酮 （ polyvinylpyrolidone, PVP)包被 硅膠顆粒 ， 商品名為 Percoll。 Percoll具有以下 優(yōu)點(diǎn) ： ①穩(wěn)定性很好，可長期保存； ②密度稀釋范圍較大，可包括大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞的密度； ③在溶液內(nèi)產(chǎn)生的滲透壓很小，故在全部密度范圍內(nèi)能保持等張； ④黏度低，即使在最大密度時(shí)也是如此，因此用較小的離心力和較短的時(shí)間就可達(dá)良好的分離效果； ⑤對細(xì)胞無毒性，且易于從細(xì)胞制劑中洗滌除去； ⑥在高速離心（ ≥ 10， 000 r/min)時(shí)，可形成連續(xù)密度梯度； ⑦價(jià)廉，分離細(xì)胞時(shí)用量少。 因此， Percoll是一種很優(yōu)良的分離介質(zhì)，是現(xiàn)在用于分離多種哺乳動物細(xì)胞的 最常用介質(zhì)之一 。 商品 Percoll的密度一般為（ ） 不同細(xì)胞的分離方法： 密度梯度離心法 密度梯度離心法 血細(xì)胞的分離 玫瑰花環(huán)細(xì)胞的分離 連續(xù) BSA密度梯度離心法 非連續(xù) BSA密度梯度離心法 連續(xù) Percoll密度梯度離心法 非連續(xù) Percoll密度梯度離心法 低速離心速度沉降法 單位重力沉降法 簡單重力沉降法分離白細(xì)胞與紅細(xì)胞 簡單重力沉降法分離粒細(xì)胞 ： 一步密度梯度離心法分離細(xì)胞的 依據(jù) 是細(xì)胞的 密度 和 體積 。 將細(xì)胞懸液加于一種高密度介質(zhì)上，應(yīng)用低速離心，密度大于介質(zhì)的細(xì)胞通過介質(zhì)而沉淀于管底，而密度低于介質(zhì)的細(xì)胞則滯留于介質(zhì)之上，體積較大的細(xì)胞沉降較快，體積較小的細(xì)胞沉降較慢，從而將具有不同密度和大小的細(xì)胞分離開來。 一步密度梯度離心法常用于分離血細(xì)胞和形成玫瑰花環(huán)的淋巴細(xì)胞。 一步密度梯度法常用的分離介質(zhì)是： FicollHypaque,也可用 Percoll,動物血清 ,BSA等。 等密度梯度離心法分離細(xì)胞的 依據(jù) 是細(xì)胞的 密度 。 在 等密度連續(xù)梯度 分離中，細(xì)胞在強(qiáng)離心力的作用下，通過密度逐漸增高的介質(zhì)沉降，當(dāng)其到達(dá)某一沉降距離，細(xì)胞的密度恰好等于梯度介質(zhì)的密度，因此沉降速度為 0。 在平衡狀態(tài)下，細(xì)胞在此特定位置形成一條區(qū)帶而不再繼續(xù)沉降，所以具有不同密度的細(xì)胞群體便在梯度介質(zhì)的不同位置上形成區(qū)帶。 因此，等密度梯度離心法分離細(xì)胞僅僅依賴于細(xì)胞的密度。反過來，通過測定細(xì)胞停留處梯度介質(zhì)的密度，可以確定細(xì)胞的密度。 非連續(xù) 密度梯度離心法 分離細(xì)胞的原理與 連續(xù) 密度梯度離心法 是相同的，但細(xì)胞集中在介質(zhì)和介質(zhì)之間的界面上。 等密度梯度離心法采用強(qiáng)離心力，其目的僅僅是加快達(dá)到平衡的速度和減少擴(kuò)散的混合效應(yīng)。 雖然細(xì)胞體積的大小可影響建立平衡的速度，但不影響達(dá)到平衡時(shí)細(xì)胞在梯度上所處的位置。 應(yīng)用本技術(shù)分離細(xì)胞常用的梯度介質(zhì)有 BSA和 Percoll。因?yàn)榻⑵胶獾乃俣扰c介質(zhì)的黏度成反比，故采用 Percoll等低黏度介質(zhì)所制備的密度梯度離心分離細(xì)胞，可在低離心力、短時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡。 在速度沉降中，細(xì)胞的體積和密度共同影響細(xì)胞的分級分離，但 細(xì)胞體積 為主要決定因素。 細(xì)胞在單位重力下通過低密度介質(zhì)（約 g/ml）沉降，或在低離心力（通常為 100 g）作用下通過密度梯度層而沉降，此種細(xì)胞分離方法即速度沉降。 前者稱為單位重力沉降法，后者即所謂低速離心速度沉降法。 離心淘析（ centrifugal elutriation）分離技術(shù)是通過含細(xì)胞介質(zhì)溶液的流力和浮力與細(xì)胞所受離心力之間相互作用而分離細(xì)胞的一種技術(shù)。 細(xì)胞表面均帶有電荷，在電場中可向一定的方向泳動，此即細(xì)胞電泳。細(xì)胞在電場中的泳動速度與其所帶電荷密度有關(guān)。 在生理 pH條件下，絕大多數(shù)細(xì)胞帶負(fù)電荷，在電場中將向正極泳動，但不同細(xì)胞所帶負(fù)電荷密度不同，故在電場中泳動速度不同，據(jù)此可將不同類型的細(xì)胞分離開。 電泳分離細(xì)胞需要特殊的儀器設(shè)備。用于細(xì)胞電泳的儀器型號很多，其操作原理也不盡相同。某些儀器僅用于分析，有些則既可用于分析，也可用于制備。 用于制備目的 最常用的細(xì)胞電泳技術(shù) 是 自由流動電泳 和密度梯度電泳 。 采用自由流動電泳儀可以進(jìn)行細(xì)胞的連續(xù)分離，目前多用的儀器是 EIPhor VaP細(xì)胞電泳儀。 細(xì)胞電泳分離技術(shù)已用于人和動物 T,B淋巴細(xì)胞及其它一些細(xì)胞的分離，尤其以分離大鼠 T,B淋巴細(xì)胞比較成功。 優(yōu)缺點(diǎn)：細(xì)胞電泳分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是所分離的細(xì)胞完整無損，活性較高，保持原來的生物學(xué)特性，可用于許多方面的研究。其不足之處是分離方法還不太理想，重復(fù)性較差，設(shè)備復(fù)雜且價(jià)格昂貴，故一直未能推廣應(yīng)用。 密度梯度電泳分離法是用聚蔗糖或聚蔗糖／蔗糖制成密度梯度進(jìn)行電泳分離細(xì)胞的技術(shù)，樣品經(jīng)分離后，不同的細(xì)胞群體在此梯度上形成穩(wěn)定的區(qū)帶。常用的密度梯度電泳儀是 Buchler PolyPrep 200電泳儀。 密度梯度電泳技術(shù)分離細(xì)胞方法復(fù)雜，設(shè)備價(jià)格昂貴，現(xiàn)在應(yīng)用并不廣泛。 黏附于某些固相物質(zhì)如玻璃或塑料的表面，是某些類型細(xì)胞的基本生物學(xué)特性之一，但另一些細(xì)胞卻缺乏這種能力；或某些細(xì)胞的黏附能力強(qiáng)、黏附作用快，而另一些細(xì)胞黏附能力弱或黏附作用慢。 根據(jù)這種差異，可用下列方法 分離 或 消除 某些類型的細(xì)胞。 G10過柱法 根據(jù)不同細(xì)胞在玻璃或塑