【正文】 性!用WB和瞬轉(zhuǎn)對(duì)照鑒定一下!，一般兩月后（傳代10代以上）還表達(dá)你想要蛋白的單克隆可以認(rèn)為是整合了質(zhì)粒的。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系：方案一： 300mgG418加入3ml PBS溶液，濃度為100mg/ml，完全溶解后，過(guò)濾，20℃保存。方案二：（1）配制1M HEPES： HEPES（緩沖能力更強(qiáng)）粉末溶于100ml ddH2O，10N NaOH（加量較多），過(guò)濾除菌（較難過(guò)濾），4℃保存，終濃度為1mol/L。（2）5g G418溶于10ml 1M HEPES（），終濃度為500mg/ml，20℃保存。注：實(shí)驗(yàn)中采用方案二時(shí)效果較好。：用培養(yǎng)基將G418稀釋為0 ug/ml 、200 ug/ml 、300 ug/ml 、400 ug/ml、500 ug/ml 、600 ug/ml 、700 ug/ml 、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培養(yǎng)基（含有G418的完全培養(yǎng)基），每個(gè)濃度4個(gè)重復(fù)，則每次換液需各個(gè)濃度培養(yǎng)基4ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。200 ug/ml 300 ug/ml 400 ug/ml 500 ug/ml 600 ug/ml 700 ug/ml 800 ug/ml 900 ug/ml 1000 ug/ml 1100 ug/ml 1200 ug/ml3ml完全培養(yǎng)基 996 992 G418(500mg/ml) ：將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，傳代3至4次使細(xì)胞達(dá)到良好的生長(zhǎng)狀態(tài),鋪24孔板（20000/孔），12h換液，加篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)。：將培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基吸除，PBS洗滌一次，每孔加入不同濃度篩選培養(yǎng)基，隔天更換一次篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)1014天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)。 注：實(shí)驗(yàn)中所確定的最佳篩選濃度為1200ug/ml。 （20萬(wàn)/孔），第二天轉(zhuǎn)染，6小時(shí)后換新鮮正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加最佳篩選濃度培養(yǎng)基，隔天換液。注意：細(xì)胞數(shù)量不能太多，否則將會(huì)影響篩選效果（G418很難發(fā)揮作用）。（換液后培養(yǎng)過(guò)夜），細(xì)胞達(dá)50%80%時(shí)，吸出所有培養(yǎng)液，離心30004000rpm，加入2倍體積新鮮最佳篩選濃度培養(yǎng)液，混勻4℃?zhèn)溆?。，可以換用適應(yīng)性培養(yǎng)基，即6中所配制。或者可以增加血清濃度培養(yǎng)，例如原來(lái)用10%血清，此時(shí)則可以采用20%血清。，維持篩選壓力。：高倍鏡下標(biāo)記陽(yáng)性克隆，套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法篩選陽(yáng)性克隆，將其轉(zhuǎn)入多孔板培養(yǎng)?！裉篆h(huán)法：用套環(huán)套住陽(yáng)性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的培養(yǎng)孔中培養(yǎng)?！窆纬ǎ汗纬[性克隆，消化陽(yáng)性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)。：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，①提取總RNA，RTPCR檢測(cè)目的基因的表達(dá) ②western檢測(cè)目的基因。注意：轉(zhuǎn)染時(shí)壓系時(shí)細(xì)胞不能鋪的太滿(mǎn)，不然當(dāng)細(xì)胞連接緊密后，壓系時(shí)不具G418抗性的細(xì)胞死亡時(shí)極易將具有抗性的細(xì)胞一起從壁上脫落下來(lái)。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié) 一題也不是很大，那就是：在老外的一本實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中提到，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)所用培養(yǎng)基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞膜有影響，可能此時(shí)加抗生素對(duì)細(xì)胞損傷較大。因?yàn)閼c大霉素、鏈霉素、G418均是氨基糖甙類(lèi)藥物，其藥理作用完全一樣。所以沒(méi)有必要再用，而且由于另外抗生素的添加實(shí)際增加氨基糖甙類(lèi)藥物的濃度，劑量有誤差，不利于各實(shí)驗(yàn)室之間的交流，在實(shí)際操作中，培養(yǎng)液中有抗生素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)與篩選影響不大。有人認(rèn)為用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法篩選穩(wěn)定整合子較好，但這種觀(guān)點(diǎn)是很多年以前的觀(guān)點(diǎn)了，而且只是少數(shù)人的觀(guān)點(diǎn)。我兩種方法都用過(guò)，但沒(méi)有特異的比較過(guò)，感覺(jué)都可以。磷酸鈣便宜，但對(duì)溶液配置和實(shí)驗(yàn)操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精確到小數(shù)點(diǎn)后2位。脂質(zhì)體是現(xiàn)在主流的轉(zhuǎn)染試劑，從沒(méi)有人說(shuō)這種方法做整合穩(wěn)定表達(dá)不行。非脂質(zhì)體是這幾年發(fā)展很快的技術(shù)，轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性小，價(jià)格也不貴，Qiagen就有一個(gè)系列。我個(gè)人覺(jué)得不必要花太多時(shí)間在這方面，自己實(shí)驗(yàn)室用得好的技術(shù)可以堅(jiān)持，沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的可以選擇一個(gè)較著名的公司的產(chǎn)品開(kāi)始，購(gòu)買(mǎi)之前先下載個(gè)說(shuō)明書(shū)看看。有精力就比較一下幾種方法，一般的用達(dá)到目的就行了。關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。G418和篩選篩選之前由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，而且不同的廠(chǎng)家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來(lái)進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，一般變動(dòng)在100ug/ml～1000ug/ml范圍。而且不同的廠(chǎng)家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定你的細(xì)胞對(duì)這一批G418的最佳篩選濃度。盡管如此，特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是穩(wěn)定的?！斗肿涌寺　方o出了幾個(gè)常用細(xì)胞系所需G418的最佳用量。細(xì)胞系或機(jī)體G418濃度（ug/ml）中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞700～800MadinDarby犬腎細(xì)胞500人上皮A431細(xì)胞400猿CV1細(xì)胞500盤(pán)基網(wǎng)柄菌屬10～35植物10酵母125～500看下面的一個(gè)試驗(yàn)：3106個(gè)細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細(xì)胞到24孔板中，48 h后加藥篩選，此時(shí)1/300細(xì)胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。篩選9天后，觀(guān)察1/4000孔內(nèi)有兩三個(gè)克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有幾十個(gè)克隆，事實(shí)上，它們幾乎全死光了，只有幾個(gè)克隆。所以匯合度對(duì)G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過(guò)50%！加藥時(shí)間由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒(méi)有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒(méi)，最終導(dǎo)致篩選不出陽(yáng)性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開(kāi)始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每35天都要更換一次含有G418的篩選液。這時(shí)藥物濃度可以降至200ug/ml。培養(yǎng)液加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無(wú)幾。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問(wèn)題：，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡。，細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過(guò)夜之后收集培養(yǎng)液，通過(guò)濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過(guò)程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。挑選單克隆的優(yōu)化為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽(yáng)性克隆造成的不利影響以及增加陽(yáng)性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來(lái)篩選陽(yáng)性克隆。加藥后，在高倍鏡下，陽(yáng)性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽(yáng)性克隆下用記號(hào)筆做個(gè)標(biāo)記。然后刮除隱性克隆，消化陽(yáng)性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或則用套環(huán)套住陽(yáng)性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的孔中培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽(yáng)性克隆在96孔板中篩選。鑒定之后一般經(jīng)過(guò)4周左右的篩選，得到的陽(yáng)性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒(méi)有整合到基因組中的話(huà)，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機(jī)整合，會(huì)導(dǎo)致表達(dá)的目的蛋白的量產(chǎn)生很大差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達(dá)目的基因的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，強(qiáng)表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞會(huì)越來(lái)越少。這樣再次篩選是必不可少的。只有經(jīng)過(guò)2次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強(qiáng)分泌目的蛋白的，遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。最全的G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié)?。?）Protocal ： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過(guò)濾消毒，4度保存。：取待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時(shí)左右開(kāi)始加藥。：在100ug/ml～1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個(gè)梯度，比如先做個(gè)100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。: 吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。：根據(jù)培養(yǎng)基