【正文】 Ⅰ和XhoⅠ雙酶切回收插入片段和pcDNA3線性片段T4連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5α質(zhì)粒制備BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。轉(zhuǎn)化DH5α，質(zhì)粒制備。jiangql 同意菊花與刀對你的建議?；蛘吒粢欢〞r間從新使用篩選量壓一下，我不知你是否干臨床，想想抗生素的用藥原則，反向思維一下，實際上我們在篩選耐藥株呀。有時，neo表達了，但目的基因丟失了的情況也是有的。２. 我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因為有時候抗性基因會丟失，如果沒有G418，很快會形成優(yōu)勢的。培養(yǎng)基處理的個人技巧體內(nèi)的任何細胞被置于體外培養(yǎng)后，對環(huán)境都有一個適應(yīng)過程，期間細胞對培養(yǎng)液具有同化作用，即細胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細胞生長因子。當(dāng)有大量細胞死亡時，可以把G418濃度減半維持篩選。：在篩選10～14天內(nèi)能夠殺死所有細胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。這樣再次篩選是必不可少的。挑選單克隆的優(yōu)化為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來篩選陽性克隆。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加G418篩選。而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定你的細胞對這一批G418的最佳篩選濃度。脂質(zhì)體是現(xiàn)在主流的轉(zhuǎn)染試劑，從沒有人說這種方法做整合穩(wěn)定表達不行。注意：轉(zhuǎn)染時壓系時細胞不能鋪的太滿，不然當(dāng)細胞連接緊密后，壓系時不具G418抗性的細胞死亡時極易將具有抗性的細胞一起從壁上脫落下來。，可以換用適應(yīng)性培養(yǎng)基，即6中所配制。 ：用培養(yǎng)基將G418稀釋為0 ug/ml 、200 ug/ml 、300 ug/ml 、400 ug/ml、500 ug/ml 、600 ug/ml 、700 ug/ml 、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培養(yǎng)基（含有G418的完全培養(yǎng)基），每個濃度4個重復(fù)，則每次換液需各個濃度培養(yǎng)基4ml，現(xiàn)用現(xiàn)配?？梢栽诩毎麄鲙状?，分出一小部分，不加G418培養(yǎng)一段時間，然后再加你維持細胞的抗性的G418濃度培養(yǎng)一天看細胞會不會死亡，如果死亡，說明外源基因還沒有丟失。當(dāng)然，轉(zhuǎn)染效率不能太低，超過50％就相對比較容易了，10％以上的可能最后形成的細胞集落就少，而且真陽性也較少。3。培養(yǎng)SPCA1（人肺癌細胞），轉(zhuǎn)染了EGFP，然后進行了G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選，最終獲得了成功將我的實驗步驟寫出來，希望對你有所幫助。想請教各位有經(jīng)驗的高手，你們做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時有此發(fā)現(xiàn)嗎？我的也是，而且好象還有好幾種不同類型的細胞。做hela細胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長出一些細胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴散，細胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細胞簇融合在一起（我的細胞簇離的很近），就是說幾個細胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？ a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤洗細胞層，以減少可能殘存的血清的影響；b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴散；c、顯微鏡下觀察細胞完全松散開，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀d、具體消化的時間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見細胞尚未完全松散開，可以再重復(fù)的，直到松散開，能夠被吸走為止。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。加藥時間和維持濃度1，由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。但是新霉素對真核細胞無作用而G418對細菌和真核細胞都起作用。G418是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細胞的。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有幾十個克隆，事實上，它們幾乎全死光了，只有幾個克隆。關(guān)于維持濃度，有人說細胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。篩選時出現(xiàn)的問題及其解決辦法：1， 問題1。細胞形態(tài)的改變：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后陽性克隆均出現(xiàn)不同程度的細胞形態(tài)的改變。單克隆細胞的培養(yǎng)就是這樣的,我現(xiàn)在作了15個96孔板的單克隆,總共才得到大約50株單克隆在做時候應(yīng)保證每個孔中的細胞是一個,因此,我一般在200毫升的培養(yǎng)液中加入小于96個的細胞,這樣平均到每個孔中因該可以由滿意的結(jié)果你所說的現(xiàn)象我也遇到過,我也百思不得其解,只好做多一點的96孔板來補充。解決操作時間長的方法：拿一個96板，在里面隨便種一些細胞，然后用牙簽練習(xí)，我練了5～6次后非常熟練了培養(yǎng)液：最好是含15％的胎牛血清，加大營養(yǎng)，有利于細胞生長；另外一種方法是對還沒有變黃的細胞液進行過濾，過濾后的培養(yǎng)含有很多生長因子，可以作為單克隆的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后一天消化，傳到一個大皿（1：6）或者兩個大皿（1：12）。我們基本上都是這樣pick stable的，除非一些對細胞生長抑止作用強大或者apoptosis的inducer之類的基因比較難挑到stable外，一般還都能挑到stable。（需要隔一段時間再加壓篩一次），細胞也是死的厲害，不過還是可以篩到，不過需要用合適的濃度。注：實驗中采用方案二時效果較好。 （換液后培養(yǎng)過夜），細胞達50%80%時，吸出所有培養(yǎng)液，離心30004000rpm，加入2倍體積新鮮最佳篩選濃度培養(yǎng)液，混勻4℃?zhèn)溆谩＃杭毎罅繑U增后，①提取總RNA，RTPCR檢測目的基因的表達 ②western檢測目的基因。磷酸鈣便宜，但對溶液配置和實驗操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精確到小數(shù)點后2位。由于每種細胞對G418的敏感性不同，一般變動在100ug/ml～1000ug/ml范圍。所以匯合度對G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50%！加藥時間由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會占據(jù)優(yōu)勢，強表達目的蛋白的細胞會越來越少。方法同4。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。？整合是隨機發(fā)生的非同源性重組，neo基因表達而目的基因不一定都表達，所以在篩選之后還要用RTPCR的方法進一步鑒定。培養(yǎng)1014天，以最低細胞全部死亡濃度為基準，一般400800左右，篩選時比該濃度再高一個級別，維持使用篩選濃度的一半。neo基因也是這樣，而且，同一細胞中不同基因的拷貝數(shù)不會相同，不同細胞同一基因的數(shù)目也不會相同，這點可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀點理解?？梢栽俚托荒軟]有。最近的一個實驗是：3106細胞電轉(zhuǎn)后，我把電激杯中的細胞分別接種1/4000和1/1000和1/300到24孔板中，48小時后加g418篩選，這個時候接種了1/300細胞的孔會大約50%匯合，而理論上接種了1/4000細胞的孔會4%左右匯合，今天是篩選后第9天，觀察到1/4000孔有兩三個小克隆，按道理1/300孔會有2030個克隆，但實際的情況是它們幾乎全部死光了，僅有少數(shù)存活細胞！所以我認為匯合度對g418篩選影響很大，這耽誤了我將一個多月。一、回收特異性擴增片段，連入T載體。 真核重組表達載體的構(gòu)建：pcDNA3載體帶有在大腸桿菌中復(fù)制的原核序列、便于挑選帶重組質(zhì)粒細菌的抗生素抗性基因，以及表達外源DNA序列所必需的所有真核表達組件。進行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細胞應(yīng)達到60%80%覆蓋。SHG44細胞的轉(zhuǎn)染：(1)③混合溶液A和B，輕柔混合（不要振蕩），室溫孵育15min，以便脂質(zhì)體/DNA混合物形成。（3）測定外源性基因?qū)HG44細胞增殖的影響①流式細胞儀分析：SHG4SHG44vect、SHG44重組pcDNA3→單細胞懸液→70%酒精固定→裂解細胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機分析G1期和G2/M、S期比例。為避免微生物污染，所用溶液濾過滅菌，以及隨后的使用應(yīng)在無菌條件下，這是細胞慣常的做法。常見問題和解答：Q：我覺得套環(huán)法操作不如96孔辦法效率高。我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因為有時候抗性基因會丟失，如果沒有G418，很快會形成優(yōu)勢的?，F(xiàn)在很多代了，很穩(wěn)定。 Q：1。有時，neo表達了，但目的基因丟失了的情況也是有的。維持就是只要養(yǎng)這種細胞，就要維持。 ２。方法同4。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。？整合是隨機發(fā)生的非同源性重組，neo基因表達而目的基因不一定都表達，所以在篩選之后還要用RTPCR的方法進一步鑒定。通過G418篩選體系，使得未轉(zhuǎn)染成功的細胞比例不斷減少，轉(zhuǎn)染成功的細胞比例不斷增高。答：每種細胞的生長狀態(tài)和速度不同，在一些細節(jié)處理上可能也不同。極少數(shù)情況下，進入細胞的外源DNA通過系列非同源性分子間重組核連接，形成巨大的***結(jié)構(gòu)最終整合進細胞染色體。Ｇ418的這一選擇特性 ,已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動物等方面得以廣泛應(yīng)用。我兩種方法都用過，但沒有特異的比較過，感覺