【正文】 00ug/ml范圍內(nèi)確定幾個(gè)梯度，比如先做個(gè)100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。: 吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)基。：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同4。：在篩選10～14天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳G418濃度的可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個(gè)梯度的 G418的量在10天前就看不到活細(xì)胞了。假如是400ug/ml不能殺死細(xì)胞，而800ug/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，則可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml進(jìn)一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由于特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時(shí)候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，現(xiàn)在我告訴你我測(cè)試過NIH3T3細(xì)胞對(duì)G418的敏感性，我用的篩選濃度是200 ug/ml。這時(shí)你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個(gè)濃度進(jìn)行篩選。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。a 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時(shí)或者更長(zhǎng)，到細(xì)胞增長(zhǎng)接近匯合時(shí)按1：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50％～70％匯合時(shí)；b 加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，可以把G418濃度減半維持篩選。篩選10～14天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后；d 挑單克?。褐苽浼?xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個(gè)/10ul。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖。e 單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA，做RTPCR檢測(cè)目的基因是否存在。常見問題：？無怪乎兩種形式：整合在染色體中和存在于細(xì)胞質(zhì)中。沒有經(jīng)過篩選前大部分轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細(xì)胞系。？整合是隨機(jī)發(fā)生的非同源性重組，neo基因表達(dá)而目的基因不一定都表達(dá)，所以在篩選之后還要用RTPCR的方法進(jìn)一步鑒定。培養(yǎng)基處理的個(gè)人技巧體內(nèi)的任何細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，對(duì)環(huán)境都有一個(gè)適應(yīng)過程，期間細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液具有同化作用，即細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。這個(gè)過程也是細(xì)胞同化培養(yǎng)基的過程。細(xì)胞越多則其同化作用越強(qiáng)，所以細(xì)胞數(shù)目多比數(shù)目少較易生長(zhǎng)。在篩選后期，大批細(xì)胞死亡，不換液沒有死亡的細(xì)胞就會(huì)受到死亡細(xì)胞的影響，換液后殘留的少量細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的同化作用不強(qiáng)，也不利于生長(zhǎng)。我是用適應(yīng)性培養(yǎng)基來解決這一問題的：適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制a 培養(yǎng)同源細(xì)胞至半?yún)R合狀態(tài)時(shí)，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時(shí)后，吸出所有培養(yǎng)液b 離心：3000～4000rpm 10 min后，吸取上清液c 慮過：，再加入2倍體積的新鮮培養(yǎng)基，低溫凍存?zhèn)溆谩418篩選實(shí)驗(yàn)相關(guān)問題問：G418篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做，選1014天內(nèi)細(xì)胞死亡的最小濃度，然后將更高一級(jí)別的濃度應(yīng)用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，是這樣嗎？答：G418是一種細(xì)胞毒性藥物（氨基糖苷類抗生素），依不同濃度，對(duì)細(xì)胞有一定的抑制或殺傷作用，而擬轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒上帶有G418的藥代酶，能降解G418，從而使細(xì)胞獲得對(duì)G418的耐藥性。也就是說轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可以耐受G418，而未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞不能耐受G418，因而被殺滅或抑制。通過G418篩選體系，使得未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞比例不斷減少，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞比例不斷增高。如果G418濃度太高則會(huì)殺傷所有的細(xì)胞，如果G418濃度太低則沒有什么毒性，兩種情況都不能起到篩選作用。G418篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)則是先用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做，選14天內(nèi)細(xì)胞死亡的最小濃度應(yīng)用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，因?yàn)椴煌募?xì)胞對(duì)G418的耐受性也不一樣，這樣的目的是找一個(gè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞能耐受G418的工作濃度，從而為篩選轉(zhuǎn)染的細(xì)胞打下基礎(chǔ)，因?yàn)檫@種濃度只能抑制未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，而不抑制轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞的！從而起到篩選作用。建議你再多查找一下國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)手之前一定要明白其原理，要不然會(huì)很盲目，充分的準(zhǔn)備可以避免走很多不必要的彎路！問：第二次篩選要怎么做？答：第二次篩選就是將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞接種培養(yǎng)后，向培養(yǎng)液中加入G418以殺傷或抑制其中的未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，因?yàn)椴还苻D(zhuǎn)染效率多么高，都不可能是100%，所以要通過G418篩選體系（或者其他篩選體系）來篩掉那些沒有成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，此時(shí)加入G418的濃度可以略高于你第一次預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)摸索出來的“最小有效濃度”，實(shí)驗(yàn)中可以再根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行濃度的調(diào)整！問：第二次篩選是經(jīng)過第一次篩選以后，已經(jīng)篩選出一部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞了，但是因?yàn)橛行┘?xì)胞還是會(huì)丟失目的基因所以要得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞還要進(jìn)行23次篩選，這時(shí)候還是用原來預(yù)實(shí)驗(yàn)的濃度，還是要再提高一個(gè)濃度？答：你要在熒光顯微鏡下觀察一下，判斷一下細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率，也就是轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞的比例，再根據(jù)情況選用或高或低的濃度！轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞的比例越高，則加入G418的濃度就可以越低。問：我的質(zhì)粒上沒有熒光標(biāo)記，要等到篩選完了以后打動(dòng)物的，那要怎么辦呢？答：可以用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)！ 問：做G418篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)每個(gè)濃度是不是要多弄幾個(gè)孔，還是一個(gè)孔就行了？篩選的培養(yǎng)液是不是要用沒有雙抗的，做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)必須用DMEM培養(yǎng)基嗎？答：用什么培養(yǎng)基視你培養(yǎng)的細(xì)胞特性而定吧 不見得非用DMEM，一般設(shè)三個(gè)復(fù)孔就足以 各濃度3復(fù)孔，設(shè)正常對(duì)照3復(fù)孔。以1014天細(xì)胞全部死亡的濃度為篩選濃度。由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早，但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增殖較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽(yáng)性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24 h之后才開始加G418篩選 。答：每種細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和速度不同，在一些細(xì)節(jié)處理上可能也不同。我的是這樣做的：G418篩選實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，生長(zhǎng)較快，所以在96孔板中加入100ul細(xì)胞（2000/ml），第二天就加入G418，從0，100，200…1000μg/ml，復(fù)3孔，每天觀察。前幾天，低濃度的孔中細(xì)胞生長(zhǎng)，中濃度的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，高濃度的不長(zhǎng)，稀稀拉拉。約一周左右，中濃度的孔中出現(xiàn)死細(xì)胞，低濃度的死細(xì)胞較少，未加G418的孔長(zhǎng)得很密。 14天時(shí)，觀察細(xì)胞全部死亡的最低濃度孔，在500 μg/ml，做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)選用的600 μg/ml。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：24孔板，細(xì)胞密度也較小，轉(zhuǎn)染后第二天1：10稀釋傳代，設(shè)立空白細(xì)胞對(duì)照組，第三天加G418（600μg/ml）。耐心等待2周，前一周細(xì)胞死亡較少，后一周死細(xì)胞較多，可3天換液，待對(duì)照組里的細(xì)胞全部死亡，就可以開始挑單克隆了G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系原理分析轉(zhuǎn)化的功能和表達(dá)需要DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞染色體。外源基因進(jìn)入細(xì)胞后，部分能夠通過細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞類型，至多80％的進(jìn)入核內(nèi)的外源DNA得到瞬時(shí)表達(dá)。極少數(shù)情況下，進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA通過系列非同源性分子間重組核連接，形成巨大的***結(jié)構(gòu)最終整合進(jìn)細(xì)胞染色體。細(xì)胞基因組自由部分表達(dá)，所以整合并不一定意味著表達(dá)，只有整合到表達(dá)區(qū)的基因才會(huì)表達(dá)，而且整合到不同的染色體區(qū)段的外源基因的表達(dá)的量也是不同的。由于攝取、整合、表達(dá)外源基因是小概率事件，通常根據(jù)新表型篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。一般情況下這種新表型由共轉(zhuǎn)染的編碼抗生素抗性基因提供。細(xì)菌Tn5轉(zhuǎn)座子序列（neo抗性基因）攜帶的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式。G418是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成,對(duì)原核和真核等細(xì)胞都有毒性 ,包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ,也包括原生動(dòng)物和蠕蟲。是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的選擇試劑。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后 ,則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA,從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá) ,使細(xì)胞獲得抗性而能在含有Ｇ418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。Ｇ418的這一選擇特性 ,已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛應(yīng)用。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞膜受到影響，抗生素可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)染時(shí)不加其它抗生素。其實(shí)G418本身有很好的殺菌效果，在用G418進(jìn)行篩選的過程中很少會(huì)發(fā)生污染。但有一點(diǎn)，其實(shí)我覺得問題也不是很大，那就是：在老外的一本實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中提到，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)所用培養(yǎng)基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞膜有影響，可能此時(shí)加抗生素對(duì)細(xì)胞損傷較大。因?yàn)閼c大霉素、鏈霉素、G418均是氨基糖甙類藥物，其藥理作用完全一樣。所以沒有必要再用，而且由于另外抗生素的添加實(shí)際增加氨基糖甙類藥物的濃度，劑量有誤差，不利于各實(shí)驗(yàn)室之間的交流，在實(shí)際操作中，培養(yǎng)液中有抗生素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)與篩選影響不大。有人認(rèn)為用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法篩選穩(wěn)定整合子較好，但這種觀點(diǎn)是很多年以前的觀點(diǎn)了，而且只是少數(shù)人的觀點(diǎn)。我兩種方法都用過，但沒有特異的比較過，感覺都可以。磷酸鈣便宜，但對(duì)溶液配置和實(shí)驗(yàn)操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精確到小數(shù)點(diǎn)后2位。脂質(zhì)體是現(xiàn)在主流的轉(zhuǎn)染試劑，從沒有人說這種方法做整合穩(wěn)定表達(dá)不行。非脂質(zhì)體是這幾年發(fā)展很快的技術(shù)，轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性小，價(jià)格也不貴，Qiagen就有一個(gè)系列。我個(gè)人覺得不必要花太多時(shí)間在這方面，自己實(shí)驗(yàn)室用得好的技術(shù)可以堅(jiān)持，沒有經(jīng)驗(yàn)的可以選擇一個(gè)較著名的公司的產(chǎn)品開始，購(gòu)買之前先下載個(gè)說明書看看。有精力就比較一下幾種方法，一般的用達(dá)到目的就行了。關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)