【正文】 更換轉染培養(yǎng)基，加入23ml新鮮生長培養(yǎng)基。(3) 準備不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以確定每個細胞系的最佳比例。一般要求，6孔培養(yǎng)皿（35mm），每孔12ml培養(yǎng)基3105細胞。 G418篩選濃度測定：SHG44培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板→G418 分別用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各濃度3復孔，設正常對照3復孔。重組質粒與pcDNA3分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切回收插入片段和pcDNA3線性片段T4連接酶連接轉化DH5α質粒制備BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。轉化DH5α，質粒制備。核酸貯存液，過濾除菌。勤換液，去除死細胞，可以減少對存活細胞的影響。jiangql 同意菊花與刀對你的建議。僅是我從臨床抗生素和化療藥的使用原則中悟出的道理，實在是個人經驗，而且在基礎科學領域頂多算票友，我還是想聽聽諸位專業(yè)人士的理解和經驗?；蛘吒粢欢〞r間從新使用篩選量壓一下，我不知你是否干臨床，想想抗生素的用藥原則，反向思維一下，實際上我們在篩選耐藥株呀。我們用neo，實際上是篩選的外源基因整合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的例子來說，如果我們抓著5個紅球，另一次抓著10個紅球，可以肯定，第二次抓的球比較多，那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。有時，neo表達了，但目的基因丟失了的情況也是有的。 操作用96孔板法，每代細胞長滿后，大多數(shù)凍存，留200cell左右就可以進行該操作了， 該方法在很多關于單克隆抗體和細胞原代培養(yǎng)書中均有講述。２. 我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因為有時候抗性基因會丟失，如果沒有G418，很快會形成優(yōu)勢的。我是用適應性培養(yǎng)基來解決這一問題的：適應性培養(yǎng)基的配制 a 培養(yǎng)同源細胞至半?yún)R合狀態(tài)時，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時后，吸出所有培養(yǎng)液b 離心：3000～4000rpm 10 min后，吸取上清液c 慮過：，再加入2倍體積的新鮮培養(yǎng)基，低溫凍存?zhèn)溆谩Ｅ囵B(yǎng)基處理的個人技巧體內的任何細胞被置于體外培養(yǎng)后，對環(huán)境都有一個適應過程，期間細胞對培養(yǎng)液具有同化作用，即細胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產物和其它一些物質，其中有排泄物也有促細胞生長因子。e 單克隆鑒定：細胞大量擴增后，提取總RNA，做RTPCR檢測目的基因是否存在。當有大量細胞死亡時，可以把G418濃度減半維持篩選。這時你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個濃度進行篩選。：在篩選10～14天內能夠殺死所有細胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。：在100ug/ml～1000ug/ml范圍內確定幾個梯度，比如先做個100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。這樣再次篩選是必不可少的。鑒定之后一般經過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。挑選單克隆的優(yōu)化為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以應用套環(huán)法或刮除法結合有限稀釋法來篩選陽性克隆。這時會出現(xiàn)兩個問題：，導致那些有neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性克隆，一般要在轉染24小時之后才開始加G418篩選。G418濃度（ug/ml）中國倉鼠卵巢細胞700～800MadinDarby犬腎細胞500人上皮A431細胞400猿CV1細胞500盤基網(wǎng)柄菌屬10～35植物10酵母125～500看下面的一個試驗：3106個細胞電轉后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細胞到24孔板中，48 h后加藥篩選，此時1/300細胞孔內大約50%匯合度。而且不同的廠家生產的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定你的細胞對這一批G418的最佳篩選濃度。關鍵是實驗設計。脂質體是現(xiàn)在主流的轉染試劑，從沒有人說這種方法做整合穩(wěn)定表達不行。所以沒有必要再用，而且由于另外抗生素的添加實際增加氨基糖甙類藥物的濃度，劑量有誤差，不利于各實驗室之間的交流，在實際操作中，培養(yǎng)液中有抗生素對細胞培養(yǎng)與篩選影響不大。注意：轉染時壓系時細胞不能鋪的太滿，不然當細胞連接緊密后，壓系時不具G418抗性的細胞死亡時極易將具有抗性的細胞一起從壁上脫落下來。：高倍鏡下標記陽性克隆，套環(huán)法或刮除法結合有限稀釋法篩選陽性克隆，將其轉入多孔板培養(yǎng)。，可以換用適應性培養(yǎng)基，即6中所配制。 （20萬/孔），第二天轉染，6小時后換新鮮正常培養(yǎng)基。 ：用培養(yǎng)基將G418稀釋為0 ug/ml 、200 ug/ml 、300 ug/ml 、400 ug/ml、500 ug/ml 、600 ug/ml 、700 ug/ml 、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培養(yǎng)基（含有G418的完全培養(yǎng)基），每個濃度4個重復，則每次換液需各個濃度培養(yǎng)基4ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。G418篩選穩(wěn)定表達細胞系：方案一： 300mgG418加入3ml PBS溶液，濃度為100mg/ml，完全溶解后，過濾，20℃保存?？梢栽诩毎麄鲙状螅殖鲆恍〔糠?，不加G418培養(yǎng)一段時間，然后再加你維持細胞的抗性的G418濃度培養(yǎng)一天看細胞會不會死亡，如果死亡，說明外源基因還沒有丟失。，不加藥培養(yǎng)2代，再加藥繼續(xù)篩選兩代，此時如果不出現(xiàn)死亡細胞則可以認為是穩(wěn)定細胞系。當然，轉染效率不能太低，超過50％就相對比較容易了，10％以上的可能最后形成的細胞集落就少，而且真陽性也較少。5，單克隆長到相對較大的集落后，于顯微鏡下用200ul槍挑取細胞集落，一般挑上48個，種在兩塊24孔板上。3。關于穩(wěn)轉的方法，好像園子里很多xdjm都用的是有限稀釋法來作，但是我們實驗室基本上都不用九十六孔做有限稀釋來作單克隆的，一般的做法都是這樣：1。培養(yǎng)SPCA1（人肺癌細胞），轉染了EGFP，然后進行了G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選，最終獲得了成功將我的實驗步驟寫出來，希望對你有所幫助。若細胞長好了,如有40%以上,就可以有限稀釋了一般，篩選5，6個克隆就有需要的克隆，但保險起見，篩10個吧。想請教各位有經驗的高手，你們做穩(wěn)定轉染時有此發(fā)現(xiàn)嗎？我的也是，而且好象還有好幾種不同類型的細胞。一般能挑到穩(wěn)定表達的概率我認為大概有70－80％，但是想挑到表達量高且能穩(wěn)定表達的，不大容易。做hela細胞的篩選，現(xiàn)在已經篩選3周，在6孔板中已經長出一些細胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴散，細胞已經四散開，和周圍的其它細胞簇融合在一起（我的細胞簇離的很近），就是說幾個細胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？ a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預熱，并且PBS潤洗細胞層，以減少可能殘存的血清的影響；b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴散；c、顯微鏡下觀察細胞完全松散開，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀d、具體消化的時間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見細胞尚未完全松散開，可以再重復的，直到松散開，能夠被吸走為止。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉染3T3細胞，在3T3細胞匯合度達到80%的時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達的克隆的話，可以調整抗生素的濃度。2，加抗生素的時機，主要是考慮插入到細胞基因組的抗性基因是否已經得到表達。加藥時間和維持濃度1，由于基因轉染到細胞內之后要一段時間才能表達出蛋白質。具體如下：將細胞稀釋到1000個細胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418濃度范圍內進行篩選，選擇出在10~14天內使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。但是新霉素對真核細胞無作用而G418對細菌和真核細胞都起作用。G418篩選穩(wěn)定表達細胞系經驗總結我做了穩(wěn)定轉染，從G418濃度確定到最后的單克隆化鑒定。G418是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質的合成而殺死細胞的。匯合度對G418篩選結果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50% 4，G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。篩選9天后，觀察1/4000孔內有兩三個克隆，按比例1/300孔內應該有幾十個克隆，事實上，它們幾乎全死光了，只有幾個克隆。這時藥物濃度可以降至200ug/ml。關于維持濃度，有人說細胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性，應不斷提高其濃度。這時會出現(xiàn)兩個問題：1， 死亡的細胞會裂解釋放出有害物質，導致那些有neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液2 ，孔中細胞數(shù)目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。篩選時出現(xiàn)的問題及其解決辦法：1， 問題1。篩選成功的概率：只要有抗性加壓篩選，挑選到的機率還是比較大的。細胞形態(tài)的改變：穩(wěn)定轉染后陽性克隆均出現(xiàn)不同程度的細