【正文】 我個(gè)人覺得不必要花太多時(shí)間在這方面，自己實(shí)驗(yàn)室用得好的技術(shù)可以堅(jiān)持，沒有經(jīng)驗(yàn)的可以選擇一個(gè)較著名的公司的產(chǎn)品開始，購買之前先下載個(gè)說明書看看。我想他的想法可能是脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞膜有影響，可能此時(shí)加抗生素對(duì)細(xì)胞損傷較大。細(xì)菌Tn5轉(zhuǎn)座子序列（neo抗性基因）攜帶的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可以將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式。 14天時(shí)，觀察細(xì)胞全部死亡的最低濃度孔，在500 μg/ml，做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)選用的600 μg/ml。問：我的質(zhì)粒上沒有熒光標(biāo)記，要等到篩選完了以后打動(dòng)物的，那要怎么辦呢？答：可以用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)！ 問：做G418篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)每個(gè)濃度是不是要多弄幾個(gè)孔，還是一個(gè)孔就行了？篩選的培養(yǎng)液是不是要用沒有雙抗的，做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)必須用DMEM培養(yǎng)基嗎？答：用什么培養(yǎng)基視你培養(yǎng)的細(xì)胞特性而定吧 不見得非用DMEM，一般設(shè)三個(gè)復(fù)孔就足以 各濃度3復(fù)孔，設(shè)正常對(duì)照3復(fù)孔。在篩選后期，大批細(xì)胞死亡，不換液沒有死亡的細(xì)胞就會(huì)受到死亡細(xì)胞的影響，換液后殘留的少量細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的同化作用不強(qiáng)，也不利于生長。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，現(xiàn)在我告訴你我測(cè)試過NIH3T3細(xì)胞對(duì)G418的敏感性，我用的篩選濃度是200 ug/ml。：取待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時(shí)左右開始加藥。Another answer:，如果整合發(fā)生在活性轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)區(qū)，則有利于表達(dá)。neo的產(chǎn)物是酶，過高的G４１８濃度就要有更多的neo酶來支持，否則細(xì)胞也要被毒死的，而此時(shí)過多的酶要求會(huì)對(duì)細(xì)胞代謝造成太大負(fù)擔(dān)，細(xì)胞可能因此無法完成分裂與增殖，我們?cè)囘^，即使在同一轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，在不同濃度的G418液中生長速度也不同，嚴(yán)重形態(tài)也不同。紅球就是neo，黃球就是你的目的基因。在細(xì)胞用胰酶進(jìn)行傳代時(shí)，此時(shí)細(xì)胞膜受到一定影響，如果培養(yǎng)基中存在G418對(duì)細(xì)胞是否有影響？ 4。Q：請(qǐng)問：能談一談單克隆化操作的步驟以及其與目的基因表達(dá)的關(guān)系嗎？A：轉(zhuǎn)染后，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)目的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的，目的蛋白表達(dá)有的多，有的少，外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞由于代謝負(fù)荷較小，所以生長較快，在生長若干代之后，表達(dá)少的細(xì)胞會(huì)形成優(yōu)勢(shì)，長期之后，表達(dá)最弱的細(xì)胞會(huì)由于競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)占主要，轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因后，表達(dá)越來越暗就是這個(gè)道理。我自己認(rèn)為，從理論上講，如果穩(wěn)定表達(dá)最好要一直篩選到細(xì)胞傳代后。 轉(zhuǎn)染24hr后施加篩選壓力，改用含G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)。(4) 試劑準(zhǔn)備 HBS（Hepesbuffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,補(bǔ)ddH2O至100ml, ，濾過除菌。一般5～7天后G418就可以減半維持。 5. 胰酶的作用不必理會(huì)，有的細(xì)胞受影響，還有的細(xì)胞不受影響，由幾代之后，不受影響的細(xì)胞會(huì)占優(yōu)勢(shì)的。紅球就是neo，黃球就是你的目的基因。所以，要進(jìn)行單克隆化操作，使得到的均來自于同一祖先細(xì)胞，遺傳性狀盡量一致，也是對(duì)高表達(dá)細(xì)胞的保護(hù)。在篩選后期，大批細(xì)胞死亡，不換液沒有死亡的細(xì)胞就會(huì)受到死亡細(xì)胞的影響，換液后殘留的少量細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的同化作用不強(qiáng)，也不利于生長。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞 ，現(xiàn)在我告訴你我測(cè)試過NIH3T3細(xì)胞對(duì)G418的敏感性，我用的篩選濃度是200 ug/ml。：取待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)6小時(shí)左右開始加藥。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。培養(yǎng)液加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無幾。細(xì)胞系或機(jī)體有精力就比較一下幾種方法，一般的用達(dá)到目的就行了。因?yàn)閼c大霉素、鏈霉素、G418均是氨基糖甙類藥物，其藥理作用完全一樣。 注：實(shí)驗(yàn)中所確定的最佳篩選濃度為1200ug/ml。 原因：瞬轉(zhuǎn)是在強(qiáng)啟動(dòng)子下,穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)你得到的細(xì)胞株可能失去了此啟動(dòng)子,或者是改變了細(xì)胞的生理特性!用WB和瞬轉(zhuǎn)對(duì)照鑒定一下!，一般兩月后（傳代10代以上）還表達(dá)你想要蛋白的單克隆可以認(rèn)為是整合了質(zhì)粒的。，再傳代時(shí)保證板子不影響細(xì)胞貼壁，避免出現(xiàn)傳代后細(xì)胞浮起來后死亡的現(xiàn)象。依據(jù)細(xì)胞不同，大概從加入G418的第三天到第八天之間細(xì)胞開始出現(xiàn)大量死亡，活下來的細(xì)胞就形成單克隆。一般來說，每一列都會(huì)有某個(gè)孔中只有1~2個(gè)細(xì)胞。單克隆化的時(shí)機(jī)和個(gè)數(shù)：加藥篩選時(shí), 一般等到確認(rèn)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞長到70%以上時(shí),再做有限稀釋法, 以克隆出陽性細(xì)胞, 同時(shí)要保持適當(dāng)?shù)乃幬餄舛?以防突變和污染。篩選成功的概率：只要有抗性加壓篩選，挑選到的機(jī)率還是比較大的。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問題：1， 死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時(shí)換液2 ，孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這時(shí)藥物濃度可以降至200ug/ml。匯合度對(duì)G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過50% 4，G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系經(jīng)驗(yàn)總結(jié)我做了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，從G418濃度確定到最后的單克隆化鑒定。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。2，加抗生素的時(shí)機(jī)，主要是考慮插入到細(xì)胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達(dá)。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。一般能挑到穩(wěn)定表達(dá)的概率我認(rèn)為大概有70－80％，但是想挑到表達(dá)量高且能穩(wěn)定表達(dá)的，不大容易。若細(xì)胞長好了,如有40%以上,就可以有限稀釋了一般，篩選5，6個(gè)克隆就有需要的克隆，但保險(xiǎn)起見，篩10個(gè)吧。關(guān)于穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法，好像園子里很多xdjm都用的是有限稀釋法來作，但是我們實(shí)驗(yàn)室基本上都不用九十六孔做有限稀釋來作單克隆的，一般的做法都是這樣：1。5，單克隆長到相對(duì)較大的集落后，于顯微鏡下用200ul槍挑取細(xì)胞集落，一般挑上48個(gè)，種在兩塊24孔板上。，不加藥培養(yǎng)2代，再加藥繼續(xù)篩選兩代，此時(shí)如果不出現(xiàn)死亡細(xì)胞則可以認(rèn)為是穩(wěn)定細(xì)胞系。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系：方案一： 300mgG418加入3ml PBS溶液，濃度為100mg/ml，完全溶解后，過濾，20℃保存。 （20萬/孔），第二天轉(zhuǎn)染，6小時(shí)后換新鮮正常培養(yǎng)基。：高倍鏡下標(biāo)記陽性克隆，套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法篩選陽性克隆，將其轉(zhuǎn)入多孔板培養(yǎng)。所以沒有必要再用，而且由于另外抗生素的添加實(shí)際增加氨基糖甙類藥物的濃度，劑量有誤差，不利于各實(shí)驗(yàn)室之間的交流，在實(shí)際操作中，培養(yǎng)液中有抗生素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)與篩選影響不大。關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。G418濃度（ug/ml）中國倉鼠卵巢細(xì)胞700～800MadinDarby犬腎細(xì)胞500人上皮A431細(xì)胞400猿CV1細(xì)胞500盤基網(wǎng)柄菌屬10～35植物10酵母125～500看下面的一個(gè)試驗(yàn)：3106個(gè)細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細(xì)胞到24孔板中，48 h后加藥篩選，此時(shí)1/300細(xì)胞孔內(nèi)大約50%匯合度。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問題：，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡。鑒定之后一般經(jīng)過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。：在100ug/ml～1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個(gè)梯度，比如先做個(gè)100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。這時(shí)你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個(gè)濃度進(jìn)行篩選。e 單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA，做RTPCR檢測(cè)目的基因是否存在。我是用適應(yīng)性培養(yǎng)基來解決這一問題的：適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制 a 培養(yǎng)同源細(xì)胞至半?yún)R合狀態(tài)時(shí)，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時(shí)后，吸出所有培養(yǎng)液b 離心：3000～4000rpm 10 min后，吸取上清液c 慮過：，再加入2倍體積的新鮮培養(yǎng)基，低溫凍存?zhèn)溆谩?操作用96孔板法，每代細(xì)胞長滿后，大多數(shù)凍存，留200cell左右就可以進(jìn)行該操作了， 該方法在很多關(guān)于單克隆抗體和細(xì)胞原代培養(yǎng)書中均有講述。我們用neo，實(shí)際上是篩選的外源基因整合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的例子來說，如果我們抓著5個(gè)紅球，另一次抓著10個(gè)紅球，可以肯定，第二次抓的球比較多，那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。僅是我從臨床抗生素和化療藥的使用原則中悟出的道理，實(shí)在是個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，而且在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域頂多算票友，我還是想聽聽諸位專業(yè)人士的理解和經(jīng)驗(yàn)。勤換液，去除死細(xì)胞，可以減少對(duì)存活細(xì)胞的影響。核酸貯存液，過濾除菌。 G418篩選濃度測(cè)定：SHG44培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板→G418 分別用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各濃度3復(fù)孔，設(shè)正常對(duì)照3復(fù)孔。 準(zhǔn)備不同比例的DOSPER/ DNA混合物，以確定每個(gè)細(xì)胞系的最佳比例。 預(yù)備脂質(zhì)體/DNA混合物必須在無血清下進(jìn)行。不知這種觀點(diǎn)對(duì)不對(duì)。所以，要進(jìn)行單克隆化操作，使得到的均來自于同一祖先細(xì)胞，遺傳性狀盡量一致，也是對(duì)高表達(dá)細(xì)胞的保