【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同4。：在篩選10～14天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳G418濃度的可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情況：用某一濃度G418的量在篩選14天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個(gè)梯度的 G418的量在10天前就看不到活細(xì)胞了。假如是400ug/ml不能殺死細(xì)胞，而800ug/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒耍瑒t可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml進(jìn)一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由于特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時(shí)候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞 ，現(xiàn)在我告訴你我測(cè)試過NIH3T3細(xì)胞對(duì)G418的敏感性，我用的篩選濃度是200 ug/ml。這時(shí)你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個(gè)濃度進(jìn)行篩選。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。a 轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時(shí)或者更長(zhǎng)，到細(xì)胞增長(zhǎng)接近匯合時(shí)按1：4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50％～70％匯合時(shí)；b 加G418:去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選培養(yǎng)基。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時(shí)，可以把G418濃度減半維持篩選。 篩選10～14天后，可見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后；d 挑單克?。褐苽浼?xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個(gè)/10ul。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48孔中增殖。e 單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA，做RTPCR檢測(cè)目的基因是否存在。常見問題：？無怪乎兩種形式：整合在染色體中和存在于細(xì)胞質(zhì)中。沒有經(jīng)過篩選前大部分轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細(xì)胞系。？整合是隨機(jī)發(fā)生的非同源性重組，neo基因表達(dá)而目的基因不一定都表達(dá)，所以在篩選之后還要用RTPCR的方法進(jìn)一步鑒定。培養(yǎng)基處理的個(gè)人技巧體內(nèi)的任何細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，對(duì)環(huán)境都有一個(gè)適應(yīng)過程，期間細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液具有同化作用，即細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時(shí)，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。這個(gè)過程也是細(xì)胞同化培養(yǎng)基的過程。細(xì)胞越多則其同化作用越強(qiáng)，所以細(xì)胞數(shù)目多比數(shù)目少較易生長(zhǎng)。在篩選后期，大批細(xì)胞死亡，不換液沒有死亡的細(xì)胞就會(huì)受到死亡細(xì)胞的影響，換液后殘留的少量細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的同化作用不強(qiáng)，也不利于生長(zhǎng)。我是用適應(yīng)性培養(yǎng)基來解決這一問題的：適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制 a 培養(yǎng)同源細(xì)胞至半?yún)R合狀態(tài)時(shí)，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時(shí)后，吸出所有培養(yǎng)液b 離心：3000～4000rpm 10 min后，吸取上清液c 慮過：，再加入2倍體積的新鮮培養(yǎng)基，低溫凍存?zhèn)溆?。eeflying 1. G418篩選要做預(yù)試驗(yàn)確定最佳濃度，將細(xì)胞稀釋至1000cell/mL，每孔100uL加入有培養(yǎng)基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100ng/mL等12個(gè)級(jí)別。培養(yǎng)1014天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，一般400800左右，篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級(jí)別，維持使用篩選濃度的一半。２. 我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因?yàn)橛袝r(shí)候抗性基因會(huì)丟失，如果沒有G418，很快會(huì)形成優(yōu)勢(shì)的。 ３. 即是有G418抗性，也不一定有目的基因，單克隆化操作是很重要的。轉(zhuǎn)染后，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)目的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的，目的蛋白表達(dá)有的多，有的少，外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞由于代謝負(fù)荷較小，所以生長(zhǎng)較快，在生長(zhǎng)若干代之后，表達(dá)少的細(xì)胞會(huì)形成優(yōu)勢(shì)，長(zhǎng)期之后，表達(dá)最弱的細(xì)胞會(huì)由于競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)占主要，轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因后，表達(dá)越來越暗就是這個(gè)道理。所以，要進(jìn)行單克隆化操作，使得到的均來自于同一祖先細(xì)胞，遺傳性狀盡量一致，也是對(duì)高表達(dá)細(xì)胞的保護(hù)。 操作用96孔板法，每代細(xì)胞長(zhǎng)滿后，大多數(shù)凍存，留200cell左右就可以進(jìn)行該操作了， 該方法在很多關(guān)于單克隆抗體和細(xì)胞原代培養(yǎng)書中均有講述。1. 可以肯定的是，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機(jī)的而且不是單拷貝的，這點(diǎn)我們做過FISH驗(yàn)證過，表達(dá)量與整合數(shù)目，上游序列特性，特定部位DNA立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了SV40只是增加了表達(dá)了數(shù)目，但并不能掩蓋其它因素對(duì)表達(dá)的影響。按你的講法，轉(zhuǎn)染完GFP的細(xì)胞應(yīng)該亮度一致，但實(shí)際上差別很大。neo基因也是這樣，而且，同一細(xì)胞中不同基因的拷貝數(shù)不會(huì)相同，不同細(xì)胞同一基因的數(shù)目也不會(huì)相同，這點(diǎn)可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀點(diǎn)理解。有時(shí)，neo表達(dá)了，但目的基因丟失了的情況也是有的。 2. 那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，某一細(xì)胞內(nèi)隨機(jī)含有一定數(shù)目拷貝數(shù)外源基因，那么，一種基因拷貝數(shù)為0的可能性，及所有拷貝均為另一種基因的概率就很小，很大的概率為外源基因的不均質(zhì)。打個(gè)比方，一個(gè)大口袋，抓100個(gè)紅球，再抓100個(gè)黃球，然后以從中抓若干個(gè)，這些球均為紅球的概率有多大呢？應(yīng)該是很小的。紅球就是neo，黃球就是你的目的基因。我們用neo，實(shí)際上是篩選的外源基因整合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的例子來說，如果我們抓著5個(gè)紅球，另一次抓著10個(gè)紅球，可以肯定，第二次抓的球比較多，那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。因?yàn)槎叱霈F(xiàn)的概率比是恒定的。3. 維持就是只要養(yǎng)這種細(xì)胞，就要維持。可以再低些，但不能沒有?；蛘吒粢欢〞r(shí)間從新使用篩選量壓一下，我不知你是否干臨床，想想抗生素的用藥原則，反向思維一下，實(shí)際上我們?cè)诤Y選耐藥株呀。4. neo的產(chǎn)物是酶，過高的G418濃度就要有更多的neo酶來支持，否則細(xì)胞也要被毒死的，而此時(shí)過多的酶要求會(huì)對(duì)細(xì)胞代謝造成太大負(fù)擔(dān)，細(xì)胞可能因此無法完成分裂與增殖，我們?cè)囘^，即使在同一轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，在不同濃度的G418液中生長(zhǎng)速度也不同，嚴(yán)重形態(tài)也不同。這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的，用米氏方程理解吧。 5. 胰酶的作用不必理會(huì)，有的細(xì)胞受影響，還有的細(xì)胞不受影響，由幾代之后，不受影響的細(xì)胞會(huì)占優(yōu)勢(shì)的。僅是我從臨床抗生素和化療藥的使用原則中悟出的道理，實(shí)在是個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，而且在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域頂多算票友，我還是想聽聽諸位專業(yè)人士的理解和經(jīng)驗(yàn)。在第10天左右就手挑單克隆或者96孔板單克隆操作了本帖開始我就講了如何確定基準(zhǔn)濃度，篩選濃度是基準(zhǔn)濃度的高一級(jí)，維持用篩選濃度的一半。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié) 三 匯合度(confluence)也許是我們實(shí)驗(yàn)室的翻譯，實(shí)際上就是指細(xì)胞占培養(yǎng)表面的比例，如果細(xì)胞鋪滿了整個(gè)容器，我們就認(rèn)為它們100%匯合，也就是匯合度100%。最近的一個(gè)實(shí)驗(yàn)是：3106細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，我把電激杯中的細(xì)胞分別接種1/4000和1/1000和1/300到24孔板中，48小時(shí)后加g418篩選，這個(gè)時(shí)候接種了1/300細(xì)胞的孔會(huì)大約50%匯合，而理論上接種了1/4000細(xì)胞的孔會(huì)4%左右匯合，今天是篩選后第9天，觀察到1/4000孔有兩三個(gè)小克隆，按道理1/300孔會(huì)有2030個(gè)克隆，但實(shí)際的情況是它們幾乎全部死光了，僅有少數(shù)存活細(xì)胞！所以我認(rèn)為匯合度對(duì)g418篩選影響很大，這耽誤了我將一個(gè)多月。jiangql 同意菊花與刀對(duì)你的建議。我的感覺G418篩選時(shí)間太長(zhǎng)，到后來一般會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有影響。以下是一些建議，供參考：首先需要擴(kuò)增細(xì)胞，凍存部分中間產(chǎn)物細(xì)胞后，再做克隆化比較合適，否則一旦污染就會(huì)全軍覆沒。一般5～7天后G418就可以減半維持。勤換液，去除死細(xì)胞，可以減少對(duì)存活細(xì)胞的影響。血清濃度可以高到20％，質(zhì)量要好。 進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染的一般程序：克隆目的基因（經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證）—準(zhǔn)備真核表達(dá)載體－將目的基因插入表達(dá)載體中－轉(zhuǎn)染－篩選－鑒定下面以pcDNA3為載體，p16為目的基因，介紹真核轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)操作。一、 試劑準(zhǔn)備 HBS（Hepesbuffered saline）：876mg NaCl溶于90ml ddH2O，加入1M Hepes,補(bǔ)ddH2O至100ml, ，濾過除菌。核酸貯存液，過濾除菌。培養(yǎng)基：含血清或不含血清的，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的正常培養(yǎng)。二、操作步驟（一）克隆目的基因根據(jù)GenBank檢索的目的基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并在上、下游引物的5’端分別引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ，行RTPCR。回收特異性擴(kuò)增片段，連入T載體。轉(zhuǎn)化DH5α，質(zhì)粒制備。酶切初步鑒定，測(cè)序證實(shí)。（二） 真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建：pcDNA3載體帶有在大腸桿菌中復(fù)制的原核序列、便于挑選帶重組質(zhì)粒細(xì)菌的抗生素抗性基因，以及表達(dá)外源DNA序列所必需的所有真核表達(dá)組件。重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切回收插入片段和pcDNA3線性片段T4連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5α質(zhì)粒制備BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。（三）重組pcDNA3轉(zhuǎn)染SHG44細(xì)胞： G418篩選濃度測(cè)定：SHG44培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板→G418 分別用100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L加入，各濃度3復(fù)孔，設(shè)正常對(duì)照3復(fù)孔。以1014天細(xì)胞全部死亡的濃度為篩選濃度，結(jié)果為200mg/L。 在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達(dá)到60%80%覆蓋。一般要求，6孔培養(yǎng)皿（35mm），每孔12ml培養(yǎng)基310