【正文】 護(hù)。既然細(xì)胞表達(dá)neo,從理論上講是否無論多大濃度的G418對(duì)之都無影響？A：，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機(jī)的而且不是單拷貝的，這點(diǎn)我們做過FISH驗(yàn)證過，表達(dá)量與整合數(shù)目，上游序列特性，特定部位DNA立體結(jié)構(gòu)都是相關(guān)的，裝入了SV40只是增加了表達(dá)了數(shù)目，但并不能掩蓋其它因素對(duì)表達(dá)的影響。我們用neo，實(shí)際上是篩選的外源基因整合的數(shù)目，怎么說呢？用剛才的例子來說，如果我們抓著５個(gè)紅球，另一次抓著１０個(gè)紅球，可以肯定，的二次抓的球比較多，那么第二次黃球數(shù)目比第一次多的概率就很大了。這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的，用米氏方程理解吧。通常用的載體是靠非同源重組隨機(jī)整合的，所以為了獲得高表達(dá)細(xì)胞株，需要對(duì)重組克隆進(jìn)行篩選。：在100ug/ml～1000ug/ml范圍內(nèi)確定幾個(gè)梯度，比如先做個(gè)100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋G418制成篩選培養(yǎng)基。這時(shí)你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三個(gè)濃度進(jìn)行篩選。e 單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA，做RTPCR檢測(cè)目的基因是否存在。我是用適應(yīng)性培養(yǎng)基來解決這一問題的：適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制a 培養(yǎng)同源細(xì)胞至半?yún)R合狀態(tài)時(shí)，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時(shí)后，吸出所有培養(yǎng)液b 離心：3000～4000rpm 10 min后，吸取上清液c 慮過：，再加入2倍體積的新鮮培養(yǎng)基，低溫凍存?zhèn)溆?。?014天細(xì)胞全部死亡的濃度為篩選濃度。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：24孔板，細(xì)胞密度也較小，轉(zhuǎn)染后第二天1：10稀釋傳代，設(shè)立空白細(xì)胞對(duì)照組，第三天加G418（600μg/ml）。G418是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成,對(duì)原核和真核等細(xì)胞都有毒性 ,包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ,也包括原生動(dòng)物和蠕蟲。因?yàn)閼c大霉素、鏈霉素、G418均是氨基糖甙類藥物，其藥理作用完全一樣。有精力就比較一下幾種方法，一般的用達(dá)到目的就行了。非脂質(zhì)體是這幾年發(fā)展很快的技術(shù)，轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性小，價(jià)格也不貴，Qiagen就有一個(gè)系列。但有一點(diǎn)，其實(shí)我覺得問題也不是很大，那就是：在老外的一本實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中提到，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)所用培養(yǎng)基中最好不加任何抗生素。一般情況下這種新表型由共轉(zhuǎn)染的編碼抗生素抗性基因提供。約一周左右，中濃度的孔中出現(xiàn)死細(xì)胞，低濃度的死細(xì)胞較少，未加G418的孔長(zhǎng)得很密。建議你再多查找一下國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)手之前一定要明白其原理，要不然會(huì)很盲目，充分的準(zhǔn)備可以避免走很多不必要的彎路！問：第二次篩選要怎么做？答：第二次篩選就是將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞接種培養(yǎng)后，向培養(yǎng)液中加入G418以殺傷或抑制其中的未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，因?yàn)椴还苻D(zhuǎn)染效率多么高，都不可能是100%，所以要通過G418篩選體系（或者其他篩選體系）來篩掉那些沒有成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，此時(shí)加入G418的濃度可以略高于你第一次預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)摸索出來的“最小有效濃度”，實(shí)驗(yàn)中可以再根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行濃度的調(diào)整！問：第二次篩選是經(jīng)過第一次篩選以后，已經(jīng)篩選出一部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞了，但是因?yàn)橛行┘?xì)胞還是會(huì)丟失目的基因所以要得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞還要進(jìn)行23次篩選，這時(shí)候還是用原來預(yù)實(shí)驗(yàn)的濃度，還是要再提高一個(gè)濃度？答：你要在熒光顯微鏡下觀察一下，判斷一下細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率，也就是轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞的比例，再根據(jù)情況選用或高或低的濃度！轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞的比例越高，則加入G418的濃度就可以越低。細(xì)胞越多則其同化作用越強(qiáng)，所以細(xì)胞數(shù)目多比數(shù)目少較易生長(zhǎng)。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孔。假如是400ug/ml不能殺死細(xì)胞，而800ug/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，則可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml進(jìn)一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由于特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時(shí)候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系PROTOCOL： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。僅是我從臨床抗生素和化療藥的使用原則中悟出的道理，實(shí)在是個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，而且在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域頂多算票友，我還是想聽聽諸位專業(yè)人士的理解和經(jīng)驗(yàn)。 ４。打個(gè)比方，一個(gè)大口袋，抓１００個(gè)紅球，再抓100個(gè)黃球，然后以從中抓若干個(gè)，這些球均為紅球的概率有多大呢？應(yīng)該是很小的。按您的講法，篩選要進(jìn)行10代，那么維持劑量要進(jìn)行多長(zhǎng)時(shí)間？如果我使用對(duì)照組,在對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后就用維持劑量進(jìn)行培養(yǎng)行嗎？ 3。即使對(duì)于同一種細(xì)胞其篩選劑量和篩選時(shí)間也不一樣。三、注意事項(xiàng) 不要移去培養(yǎng)基，逐滴加入100μl 脂質(zhì)體/DNA混合物（從培養(yǎng)孔一邊到另一邊），邊加邊輕搖培養(yǎng)板。(2) （二）以下是一些建議，供參考：首先需要擴(kuò)增細(xì)胞，凍存部分中間產(chǎn)物細(xì)胞后，再做克隆化比較合適，否則一旦污染就會(huì)全軍覆沒。這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的，用米氏方程理解吧。打個(gè)比方，一個(gè)大口袋，抓100個(gè)紅球，再抓100個(gè)黃球，然后以從中抓若干個(gè)，這些球均為紅球的概率有多大呢？應(yīng)該是很小的。轉(zhuǎn)染后，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)目的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的，目的蛋白表達(dá)有的多，有的少，外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞由于代謝負(fù)荷較小，所以生長(zhǎng)較快，在生長(zhǎng)若干代之后，表達(dá)少的細(xì)胞會(huì)形成優(yōu)勢(shì)，長(zhǎng)期之后，表達(dá)最弱的細(xì)胞會(huì)由于競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)占主要，轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因后，表達(dá)越來越暗就是這個(gè)道理。細(xì)胞越多則其同化作用越強(qiáng)，所以細(xì)胞數(shù)目多比數(shù)目少較易生長(zhǎng)。在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孔。假如是400ug/ml不能殺死細(xì)胞，而800ug/ml在第5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，則可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml進(jìn)一步篩選，以確定最佳篩選濃度！心得：由于特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是比較穩(wěn)定的，所以有時(shí)候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。最全的G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié)?。?）Protocal ： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸餾水至10ml，過濾消毒，4度保存。然后刮除隱性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或則用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的孔中培養(yǎng)。這時(shí)藥物濃度可以降至200ug/ml?！斗肿涌寺　方o出了幾個(gè)常用細(xì)胞系所需G418的最佳用量。我個(gè)人覺得不必要花太多時(shí)間在這方面，自己實(shí)驗(yàn)室用得好的技術(shù)可以堅(jiān)持，沒有經(jīng)驗(yàn)的可以選擇一個(gè)較著名的公司的產(chǎn)品開始，購(gòu)買之前先下載個(gè)說明書看看。我想他的想法可能是脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞膜有影響，可能此時(shí)加抗生素對(duì)細(xì)胞損傷較大。，維持篩選壓力。：將培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基吸除，PBS洗滌一次，每孔加入不同濃度篩選培養(yǎng)基，隔天更換一次篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)1014天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)。 單克隆化后鑒定：，通過PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)目的基因并不上調(diào)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)是增高的。除非是類似帶GFP這樣能直接觀察到是否真陽性的基因，我們才用有限稀釋法來作，要不好像也太麻煩了吧？耗時(shí)也多單克隆化后細(xì)胞特點(diǎn)和處理：：考慮質(zhì)粒的表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的影響，查文獻(xiàn)確認(rèn)一下。4。（在要進(jìn)行操作時(shí)，用酒精將手好好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會(huì)有什么問題），你可以試試，只要小心一些就行了。實(shí)驗(yàn)步驟大致為：預(yù)先對(duì)96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育，然后胰酶消化穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞，細(xì)胞液稀釋至密度為1000cell/ml的單細(xì)胞懸浮液，上述細(xì)胞液接種于96孔板的第一排，混合后，……，一直到第八排，操作示意圖見下圖。4，問題4。把細(xì)胞全部消化下來，在96孔板中逐步稀釋獲得單克隆2，問題2。篩選時(shí)的培養(yǎng)液加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無幾。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都會(huì)下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞膜受到影響，抗生素可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時(shí)不加其它抗生素。有自己的體會(huì)也有其他戰(zhàn)友遇到的情況, 和大家分享. 沒有總結(jié)好的地方，大家補(bǔ)充。一個(gè)具體試驗(yàn)：3x106個(gè)細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細(xì)胞到24孔板中，48h后加藥篩選，此時(shí)1/300細(xì)胞孔內(nèi)大約50%匯合度。一般是轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入抗生素。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。這個(gè)可能是在染色體上，合適的整合位點(diǎn)太少的緣故。5，從單克隆化時(shí)開始，就要加大營(yíng)養(yǎng)，清和生長(zhǎng)因子。我的改進(jìn)之處：我在顯微鏡下觀察，標(biāo)記孔中小于10個(gè)細(xì)胞的孔，然后在顯微鏡下用記號(hào)筆在皿底把單個(gè)熒光細(xì)胞圈住，然后在操凈臺(tái)里用滅過菌底牙簽將圈外的細(xì)胞戳死，這樣留在孔中的就是單克隆了，通過這樣的，我一共獲得了6株單克隆。長(zhǎng)到大概80％以上的時(shí)候作轉(zhuǎn)染。6。復(fù)蘇后加G418傳代2次，然后按部就班。方案二：（1）配制1M HEPES： HEPES（緩沖能力更強(qiáng)）粉末溶于100ml ddH2O，10N NaOH（加量較多），過濾除菌（較難過濾），4℃保存，終濃度為1mol/L。 300 ug/ml 500 ug/ml 700 ug/ml 900 ug/ml 1100 ug/ml 992 G418(500mg/ml) 轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加最佳篩選濃度培養(yǎng)基，隔天換液。●套環(huán)法：用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰酶