【正文】 我兩種方法都用過，但沒有特異的比較過，感覺都可以。極少數(shù)情況下，進入細胞的外源DNA通過系列非同源性分子間重組核連接，形成巨大的***結(jié)構(gòu)最終整合進細胞染色體。通過G418篩選體系，使得未轉(zhuǎn)染成功的細胞比例不斷減少，轉(zhuǎn)染成功的細胞比例不斷增高。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。 ２。維持就是只要養(yǎng)這種細胞，就要維持。 Q：1。我們掌握是傳過10代以后用維持量，但不能不用，因為有時候抗性基因會丟失，如果沒有G418，很快會形成優(yōu)勢的。（3）測定外源性基因?qū)HG44細胞增殖的影響①流式細胞儀分析：SHG4SHG44vect、SHG44重組pcDNA3→單細胞懸液→70%酒精固定→裂解細胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機分析G1期和G2/M、S期比例。③混合溶液A和B，輕柔混合（不要振蕩），室溫孵育15min，以便脂質(zhì)體/DNA混合物形成。進行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細胞應(yīng)達到60%80%覆蓋。回收特異性擴增片段，連入T載體。一、可以再低些，但不能沒有。培養(yǎng)1014天，以最低細胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，一般400800左右，篩選時比該濃度再高一個級別，維持使用篩選濃度的一半。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會占據(jù)優(yōu)勢，強表達目的蛋白的細胞會越來越少。所以匯合度對G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50%！加藥時間由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。磷酸鈣便宜，但對溶液配置和實驗操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精確到小數(shù)點后2位。（換液后培養(yǎng)過夜），細胞達50%80%時，吸出所有培養(yǎng)液，離心30004000rpm，加入2倍體積新鮮最佳篩選濃度培養(yǎng)液，混勻4℃?zhèn)溆谩? 注：實驗中采用方案二時效果較好。我們基本上都是這樣pick stable的，除非一些對細胞生長抑止作用強大或者apoptosis的inducer之類的基因比較難挑到stable外，一般還都能挑到stable。解決操作時間長的方法：拿一個96板，在里面隨便種一些細胞，然后用牙簽練習(xí)，我練了5～6次后非常熟練了培養(yǎng)液：最好是含15％的胎牛血清，加大營養(yǎng)，有利于細胞生長；另外一種方法是對還沒有變黃的細胞液進行過濾，過濾后的培養(yǎng)含有很多生長因子，可以作為單克隆的培養(yǎng)液。細胞形態(tài)的改變：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后陽性克隆均出現(xiàn)不同程度的細胞形態(tài)的改變。關(guān)于維持濃度，有人說細胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。G418是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細胞的。加藥時間和維持濃度1，由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。做hela細胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長出一些細胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴散，細胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細胞簇融合在一起（我的細胞簇離的很近），就是說幾個細胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？ a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤洗細胞層，以減少可能殘存的血清的影響；b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴散；c、顯微鏡下觀察細胞完全松散開，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀d、具體消化的時間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見細胞尚未完全松散開，可以再重復(fù)的，直到松散開，能夠被吸走為止。培養(yǎng)SPCA1（人肺癌細胞），轉(zhuǎn)染了EGFP，然后進行了G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選，最終獲得了成功將我的實驗步驟寫出來，希望對你有所幫助。3。可以在細胞傳幾代后，分出一小部分，不加G418培養(yǎng)一段時間，然后再加你維持細胞的抗性的G418濃度培養(yǎng)一天看細胞會不會死亡，如果死亡，說明外源基因還沒有丟失。 注意：轉(zhuǎn)染時壓系時細胞不能鋪的太滿，不然當(dāng)細胞連接緊密后，壓系時不具G418抗性的細胞死亡時極易將具有抗性的細胞一起從壁上脫落下來。而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定你的細胞對這一批G418的最佳篩選濃度。挑選單克隆的優(yōu)化為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來篩選陽性克隆。：在篩選10～14天內(nèi)能夠殺死所有細胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。培養(yǎng)基處理的個人技巧體內(nèi)的任何細胞被置于體外培養(yǎng)后，對環(huán)境都有一個適應(yīng)過程，期間細胞對培養(yǎng)液具有同化作用，即細胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細胞生長因子。有時，neo表達了，但目的基因丟失了的情況也是有的。jiangql 同意菊花與刀對你的建議。重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切回收插入片段和pcDNA3線性片段T4連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5α質(zhì)粒制備BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。 6hr后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入23ml新鮮生長培養(yǎng)基。但是，脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA混合物無需濾過除菌。A：. 如果克隆效率較低的細胞,如果不是每孔單個細胞,一個96孔板也只能培養(yǎng)一萬個細胞,十萬個細胞就至少需要10個板,100萬個細胞就需要100個板,對于轉(zhuǎn)基因細胞篩選或基因打靶,遠遠不如千萬個細胞共同培養(yǎng)活力好. 因此還得看這位朋友使用的是什么細胞,有限細胞系還是無限細胞系,轉(zhuǎn)基因還是非轉(zhuǎn)基因,篩選還是不篩選,需要的單細胞克隆株數(shù)量多少? ２。：在篩選10～14天內(nèi)能夠殺死所有細胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。培養(yǎng)基處理的個人技巧體內(nèi)的任何細胞被置于體外培養(yǎng)后，對環(huán)境都有一個適應(yīng)過程，期間細胞對培養(yǎng)液具有同化作用，即細胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細胞生長因子。我的是這樣做的：G418篩選實驗：轉(zhuǎn)染293細胞，生長較快，所以在96孔板中加入100ul細胞（2000/ml），第二天就加入G418，從0，100，200…1000μg/ml，復(fù)3孔，每天觀察。在進行轉(zhuǎn)染時細胞膜受到影響，抗生素可能對細胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)染時不加其它抗生素。當(dāng)neo基因被整合進真核細胞基因組合適的地方后 ,則能啟動neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA,從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達 ,使細胞獲得抗性而能在含有Ｇ418的選擇性培養(yǎng)基中生長。所以篩選不能太早，但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增殖較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24 h之后才開始加G418篩選 。沒有經(jīng)過篩選前大部分轉(zhuǎn)染進細胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細胞系。：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。胰酶的作用不必理會，有的細胞受影響，還有的細胞不受影響，由幾代之后，不受影響的細胞會占優(yōu)勢的。neo基因也是這樣，而且，同一細胞中不同基因的拷貝數(shù)不會相同，不同細胞同一基因的數(shù)目也不會相同，這點可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀點理解。必須指出，單克隆化要做幾遍，一遍是不夠的，我前十代都是這樣的，結(jié)果綠色熒光蛋白不但沒減弱，反而增強了很多。用于轉(zhuǎn)染的核酸應(yīng)高度純化。(5) 典型貼壁細胞平板密度 培養(yǎng)板大小 生長面積（cm2） 大約細胞數(shù) 培養(yǎng)基容積（ml） 組織培養(yǎng)皿（φ60mm） 28 6．6105 56 6孔培養(yǎng)板（φ35mm） 3105 12 ） 4 1．3105 0．51 24孔培養(yǎng)板（φ8mm） 0．5 0．6105 0．250．5 G418篩選穩(wěn)定表達細胞系總結(jié) 三 匯合度(confluence)也許是我們實驗室的翻譯，實際上就是指細胞占培養(yǎng)表面的比例，如果細胞鋪滿了整個容器，我們就認為它們100%匯合，也就是匯合度100%。按你的講法，轉(zhuǎn)染完GFP的細胞應(yīng)該亮度一致，但實際上差別很大。沒有經(jīng)過篩選前大部分轉(zhuǎn)染進細胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細胞系。：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細胞，在3T3細胞匯合度達到80%的時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。具體如下：將細胞稀釋到1000個細胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗?！窆纬ǎ汗纬[性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)。 ，G418的濃度有人認為需要比穩(wěn)轉(zhuǎn)時小寫，此外，加藥后對蛋白質(zhì)的表達，細胞形態(tài)有影響，因此做功能時要停藥培養(yǎng)合適時間后再做。2。單克隆化的操作方法；。3，適當(dāng)增加血清濃度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。neo就是編碼3‘磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達的蛋白能夠分解新霉素G418。當(dāng)然，抗性基因高表達，目的