【正文】 我兩種方法都用過(guò)，但沒(méi)有特異的比較過(guò)，感覺(jué)都可以。極少數(shù)情況下，進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA通過(guò)系列非同源性分子間重組核連接，形成巨大的***結(jié)構(gòu)最終整合進(jìn)細(xì)胞染色體。通過(guò)G418篩選體系，使得未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞比例不斷減少，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞比例不斷增高。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。 ２。維持就是只要養(yǎng)這種細(xì)胞，就要維持。 Q：1。我們掌握是傳過(guò)10代以后用維持量，但不能不用，因?yàn)橛袝r(shí)候抗性基因會(huì)丟失，如果沒(méi)有G418，很快會(huì)形成優(yōu)勢(shì)的。（3）測(cè)定外源性基因?qū)HG44細(xì)胞增殖的影響①流式細(xì)胞儀分析：SHG4SHG44vect、SHG44重組pcDNA3→單細(xì)胞懸液→70%酒精固定→裂解細(xì)胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上機(jī)分析G1期和G2/M、S期比例。③混合溶液A和B，輕柔混合（不要振蕩），室溫孵育15min，以便脂質(zhì)體/DNA混合物形成。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達(dá)到60%80%覆蓋。回收特異性擴(kuò)增片段，連入T載體。一、可以再低些，但不能沒(méi)有。培養(yǎng)1014天，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，一般400800左右，篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級(jí)別，維持使用篩選濃度的一半。c 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達(dá)目的基因的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，強(qiáng)表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞會(huì)越來(lái)越少。所以匯合度對(duì)G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過(guò)50%！加藥時(shí)間由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。磷酸鈣便宜，但對(duì)溶液配置和實(shí)驗(yàn)操作要求很高，尤其是溶液的PH值，要求精確到小數(shù)點(diǎn)后2位。（換液后培養(yǎng)過(guò)夜），細(xì)胞達(dá)50%80%時(shí)，吸出所有培養(yǎng)液，離心30004000rpm，加入2倍體積新鮮最佳篩選濃度培養(yǎng)液，混勻4℃?zhèn)溆谩? 注：實(shí)驗(yàn)中采用方案二時(shí)效果較好。我們基本上都是這樣pick stable的，除非一些對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑止作用強(qiáng)大或者apoptosis的inducer之類的基因比較難挑到stable外，一般還都能挑到stable。解決操作時(shí)間長(zhǎng)的方法：拿一個(gè)96板，在里面隨便種一些細(xì)胞，然后用牙簽練習(xí)，我練了5～6次后非常熟練了培養(yǎng)液：最好是含15％的胎牛血清，加大營(yíng)養(yǎng)，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)；另外一種方法是對(duì)還沒(méi)有變黃的細(xì)胞液進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的培養(yǎng)含有很多生長(zhǎng)因子，可以作為單克隆的培養(yǎng)液。細(xì)胞形態(tài)的改變：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性克隆均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞形態(tài)的改變。關(guān)于維持濃度，有人說(shuō)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)對(duì)抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。G418是新霉素的類似物，兩者都是通過(guò)抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細(xì)胞的。加藥時(shí)間和維持濃度1，由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。做hela細(xì)胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長(zhǎng)出一些細(xì)胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過(guò)程中，胰酶擴(kuò)散，細(xì)胞已經(jīng)四散開(kāi)，和周圍的其它細(xì)胞簇融合在一起（我的細(xì)胞簇離的很近），就是說(shuō)幾個(gè)細(xì)胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒(méi)有辦法做下去了，該怎么辦？ a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤(rùn)洗細(xì)胞層，以減少可能殘存的血清的影響；b、加入胰酶后，稍過(guò)幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時(shí)，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴(kuò)散；c、顯微鏡下觀察細(xì)胞完全松散開(kāi)，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀d、具體消化的時(shí)間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞尚未完全松散開(kāi)，可以再重復(fù)的，直到松散開(kāi)，能夠被吸走為止。培養(yǎng)SPCA1（人肺癌細(xì)胞），轉(zhuǎn)染了EGFP，然后進(jìn)行了G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選，最終獲得了成功將我的實(shí)驗(yàn)步驟寫(xiě)出來(lái)，希望對(duì)你有所幫助。3?？梢栽诩?xì)胞傳幾代后，分出一小部分，不加G418培養(yǎng)一段時(shí)間，然后再加你維持細(xì)胞的抗性的G418濃度培養(yǎng)一天看細(xì)胞會(huì)不會(huì)死亡，如果死亡，說(shuō)明外源基因還沒(méi)有丟失。 注意：轉(zhuǎn)染時(shí)壓系時(shí)細(xì)胞不能鋪的太滿，不然當(dāng)細(xì)胞連接緊密后，壓系時(shí)不具G418抗性的細(xì)胞死亡時(shí)極易將具有抗性的細(xì)胞一起從壁上脫落下來(lái)。而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定你的細(xì)胞對(duì)這一批G418的最佳篩選濃度。挑選單克隆的優(yōu)化為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽(yáng)性克隆造成的不利影響以及增加陽(yáng)性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來(lái)篩選陽(yáng)性克隆。：在篩選10～14天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。培養(yǎng)基處理的個(gè)人技巧體內(nèi)的任何細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，對(duì)環(huán)境都有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，期間細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液具有同化作用，即細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。有時(shí)，neo表達(dá)了，但目的基因丟失了的情況也是有的。jiangql 同意菊花與刀對(duì)你的建議。重組質(zhì)粒與pcDNA3分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切回收插入片段和pcDNA3線性片段T4連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5α質(zhì)粒制備BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。 6hr后更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，加入23ml新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。但是，脂質(zhì)體以及脂質(zhì)體/ DNA混合物無(wú)需濾過(guò)除菌。A：. 如果克隆效率較低的細(xì)胞,如果不是每孔單個(gè)細(xì)胞,一個(gè)96孔板也只能培養(yǎng)一萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞就至少需要10個(gè)板,100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞就需要100個(gè)板,對(duì)于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選或基因打靶,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞共同培養(yǎng)活力好. 因此還得看這位朋友使用的是什么細(xì)胞,有限細(xì)胞系還是無(wú)限細(xì)胞系,轉(zhuǎn)基因還是非轉(zhuǎn)基因,篩選還是不篩選,需要的單細(xì)胞克隆株數(shù)量多少? ２。：在篩選10～14天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418濃度即為最佳篩選濃度。培養(yǎng)基處理的個(gè)人技巧體內(nèi)的任何細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，對(duì)環(huán)境都有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，期間細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液具有同化作用，即細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。我的是這樣做的：G418篩選實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，生長(zhǎng)較快，所以在96孔板中加入100ul細(xì)胞（2000/ml），第二天就加入G418，從0，100，200…1000μg/ml，復(fù)3孔，每天觀察。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞膜受到影響，抗生素可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)染時(shí)不加其它抗生素。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后 ,則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA,從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá) ,使細(xì)胞獲得抗性而能在含有Ｇ418的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。所以篩選不能太早，但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增殖較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒(méi)有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒(méi)，最終導(dǎo)致篩選不出陽(yáng)性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24 h之后才開(kāi)始加G418篩選 。沒(méi)有經(jīng)過(guò)篩選前大部分轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細(xì)胞系。：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。胰酶的作用不必理會(huì)，有的細(xì)胞受影響，還有的細(xì)胞不受影響，由幾代之后，不受影響的細(xì)胞會(huì)占優(yōu)勢(shì)的。neo基因也是這樣，而且，同一細(xì)胞中不同基因的拷貝數(shù)不會(huì)相同，不同細(xì)胞同一基因的數(shù)目也不會(huì)相同，這點(diǎn)可以用數(shù)學(xué)關(guān)于泊松分布的觀點(diǎn)理解。必須指出，單克隆化要做幾遍，一遍是不夠的，我前十代都是這樣的，結(jié)果綠色熒光蛋白不但沒(méi)減弱，反而增強(qiáng)了很多。用于轉(zhuǎn)染的核酸應(yīng)高度純化。(5) 典型貼壁細(xì)胞平板密度 培養(yǎng)板大小 生長(zhǎng)面積（cm2） 大約細(xì)胞數(shù) 培養(yǎng)基容積（ml） 組織培養(yǎng)皿（φ60mm） 28 6．6105 56 6孔培養(yǎng)板（φ35mm） 3105 12 ） 4 1．3105 0．51 24孔培養(yǎng)板（φ8mm） 0．5 0．6105 0．250．5 G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié) 三 匯合度(confluence)也許是我們實(shí)驗(yàn)室的翻譯，實(shí)際上就是指細(xì)胞占培養(yǎng)表面的比例，如果細(xì)胞鋪滿了整個(gè)容器，我們就認(rèn)為它們100%匯合，也就是匯合度100%。按你的講法，轉(zhuǎn)染完GFP的細(xì)胞應(yīng)該亮度一致，但實(shí)際上差別很大。沒(méi)有經(jīng)過(guò)篩選前大部分轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細(xì)胞系。：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3~5天更換一次篩選培養(yǎng)基。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過(guò)夜之后收集培養(yǎng)液，通過(guò)濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來(lái)進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)?！窆纬ǎ汗纬[性克隆，消化陽(yáng)性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)。 ，G418的濃度有人認(rèn)為需要比穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)小寫(xiě)，此外，加藥后對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)有影響，因此做功能時(shí)要停藥培養(yǎng)合適時(shí)間后再做。2。單克隆化的操作方法；。3，適當(dāng)增加血清濃度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。neo就是編碼3‘磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達(dá)的蛋白能夠分解新霉素G418。當(dāng)然，抗性基因高表達(dá)，目的