【正文】 最高。低相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖能大大提高基因的轉(zhuǎn)染活力，且轉(zhuǎn)染效率較高相對(duì)分子質(zhì)量殼聚糖高。 Maclaughlin 等 [85]分別用不同相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖與 DNA 形成納米復(fù)合物，同時(shí)轉(zhuǎn)染COS1 細(xì)胞（常用來篩選轉(zhuǎn)染作用的細(xì)胞），發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量低于 10000 的殼聚糖形成的DNA 復(fù)合物能轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 在 含 血漿的介質(zhì)中相對(duì)分子質(zhì)量為 102022 的殼聚糖 /DNA 復(fù)合體在電荷比（ +/） 為 2:1 時(shí)轉(zhuǎn)染 COS1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率最高。 直接注射連接有 pH 敏感溶膜肽（ pH sensitive endosomolytic peptide）的殼聚糖 /DNA 納米粒子可以觀察到基因在兔子的小腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸處表達(dá)。 與殼聚糖分子上的游離氨基反應(yīng)可以制得一些它得衍生物。如三甲基殼聚糖低聚物（ TMO）、脫氧膽酸 殼聚糖 [86]、半乳糖基 殼聚糖 [87]等 。 TMO 自發(fā)地與 RSVa3熒光素酶質(zhì)粒形成 納米 復(fù)合物 [88]， 該 復(fù)合物轉(zhuǎn)染 COS1和 Caco2細(xì)胞， TMO與 DNA形成的 TMO/ DNA納米 復(fù)合物直徑為 200~500 nm， 該復(fù)合物 轉(zhuǎn)染 COS1 細(xì)胞效率低于 DOTAP/DNA 脂質(zhì)納米粒， 而 殼聚糖 /DNA 納米復(fù)合物 在 Caco2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 效率與 DOTAPDNA 脂質(zhì)納米粒相當(dāng) 。脫乙酰度為 80％的 TMO 耦聯(lián)半乳糖配基后，可以成功地特異性靶向轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞 [89]。但當(dāng)殼聚糖酯化后，由于表面 Zeta 電位降低，易發(fā)生凝聚，而且伴隨著與 DNA 的親和力下降，使得它的轉(zhuǎn)染效率降低 [90]。 3 聚乙烯亞胺類載體 （ 1） 聚乙烯亞胺及其 DNA 復(fù)合物 納米粒 的特點(diǎn) 聚乙烯亞胺（ polyethylenimine, PEI）有兩種結(jié)構(gòu)形式：線型 PEI 和支鏈型 PEI。 2取 代基 2噁 唑啉 ， （ 2substituted 2oxazoline）陽離子開環(huán)聚合 , 然后水解，可制得 線型 PEI；支鏈型 PEI 則 以 氮丙 啶 （ Azindine）為合成單元， 通過鏈增長(zhǎng)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)分子的增長(zhǎng)， 支化部分的產(chǎn)生是由于兩個(gè)增長(zhǎng)的聚合 物 分子的 活 性部位相互作用形成的 ， 鏈增長(zhǎng)終止于分子內(nèi)環(huán)化 ， 支型 PEI 的純化可采用沉淀分離 。 PEI 的質(zhì)子化能力是 PEI 成功地作為基因載體的重要參數(shù)。 pKa 可以大致反映 PEI 的質(zhì) 23 子化能力。 PEI 的質(zhì)子化程度與溶液的濃度有關(guān) [91]。 支 鏈 型 PEI 中 伯 胺 的 N 占 25% ， 仲胺N 占 50%，叔 胺 N 為 25%[92,93]，受連 接環(huán)境的影響， 三種 N 質(zhì)子化 能力有所差異，在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中所起的作用也就不一樣。據(jù)報(bào)道 [94]正電 N 與 DNA 中磷脂鍵相互作用參與了 壓 縮DNA 的過程， 仲 胺和 叔 胺中 N 在轉(zhuǎn) 染 過程起到 突破內(nèi)涵 體 膜 的作用。 Boussif 等 [95]認(rèn)為 PEI聚合物鏈中在每“第 3 原子”或“第 4 原子”都是質(zhì)子化的氨基氮原子 ,使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在很寬 pH 值的范圍內(nèi)都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿” (protonsponge)。 PEI 與 DNA 形成復(fù)合物時(shí)， DNA 壓 縮程度取決于 PEI/DNA 復(fù)合物的 N/P 比值 ,支鏈構(gòu)型的 PEI 比線型結(jié)構(gòu)的 PEI 對(duì) DNA 的緊縮能力強(qiáng)， PEIDNA 復(fù)合物的外形有管狀膠束，更多為圓突形 。 PEI/DNA 粒徑很小，大約在幾十到幾百納米之間 [96]。在電子顯微鏡下觀察 [97]，無論是線型的 PEI 還是支鏈型 PEI, 當(dāng) N/P 為 :1 時(shí)，納米復(fù)合物的粒徑大多在 20－ 40nm，支鏈型 PEI 形成的復(fù)合物少數(shù)情況下可能會(huì)形成較大的粒徑（ 240nm）。 PEI/DNA 復(fù)合物表面 Zeta 電位可達(dá)﹢ 35mv，存在較多的正電荷，正電荷中和細(xì)胞表面的負(fù)性基團(tuán)， 具有一定的細(xì)胞毒性，進(jìn)入體內(nèi)易與血漿蛋白相互作用，從而引起復(fù)合物的去穩(wěn)定性、非特異性清除，導(dǎo)致毒副作用 [98]。用 PEG 的琥珀酸酐半酯將 PEI/DNA 復(fù)合物PEG 化，體外研究表明在 N/P 比值在 2－ 6 范圍內(nèi)，表面電荷幾乎為零， PEG 化對(duì)基因的體外表達(dá)沒有影響。通過耦聯(lián)負(fù)電性蛋白如轉(zhuǎn)鐵蛋白，增加 PEI 在復(fù)合物中的密度，可以獲得 Zeta 電位近于中性的納米復(fù)合物。 （ 2） PEI/DNA 復(fù)合物 納米 粒 的轉(zhuǎn)染 作用 PEIDNA 復(fù)合物 納米 粒 可以轉(zhuǎn)染很多種類細(xì)胞 ， Boussif 等引證了 PEI/DNA 復(fù)合物可對(duì) 25 種細(xì)胞，包 種 18 種人類細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 [95]。 PEI/DNA 納米 粒 的轉(zhuǎn)染能力和轉(zhuǎn)染效率與 PEI 的相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)。 高度支化 相對(duì)分子質(zhì)量 為 25000 和 800000PEI 載體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率較高，同時(shí)也具有較大毒 性 [99]， 相對(duì)分子質(zhì)量低于 1800的 PEI沒有轉(zhuǎn)染能力 [100]，造成這種現(xiàn)象的原因至今還不清楚。 Gosselin[101]等采用可降解的二硫鍵交聯(lián)相對(duì)分子質(zhì)量為 800 的低相對(duì)分子質(zhì)量 PEI，綜合了高低相對(duì)分子質(zhì)量的優(yōu)勢(shì)，大大提高了轉(zhuǎn)染效率，毒性沒有明顯增加。相對(duì)分子質(zhì)量相同 PEI，由于支化度不同，轉(zhuǎn)染效率也有一 定的差異 [102]。 由于 PEI 在低于生理 pH 下具有相當(dāng)?shù)木彌_能力。 PEI/DNA 納米復(fù)合物通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞后，未完全質(zhì)子化的聚合物能結(jié)合溶酶體內(nèi)的 H+，從而使溶酶體內(nèi) pH 上升，導(dǎo)致 溶酶 24 體內(nèi)蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 ， 進(jìn)而 抑制降解酶活性，從而保護(hù)了 DNA 在溶酶體內(nèi) 不被 降解。因此， PEI/DNA 不需要添加破膜劑 (disruption agents),即可有效地轉(zhuǎn)染細(xì)胞 [103]。 PEI作為基因載體，與其它市售的載體相比，很穩(wěn)定，易操作。但血漿存在下， PEI/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率極低，使得該復(fù)合物應(yīng)用受限。 Guo等 [104]報(bào)道，對(duì)于哺乳類動(dòng)物任何種屬的細(xì)胞 ,葉酸 (folic acid)都能明顯加強(qiáng)該復(fù)合物在血漿中細(xì)胞轉(zhuǎn)染活性 ,不管在 PEI/DNA納米復(fù)合物形成之前或之后 ,加入葉酸都能觀察到此現(xiàn)象。而其他陰離子化合物 ,如膽酸、檸檬酸、EDTA、谷氨酸卻觀察不到這種現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)為基因傳遞及基因治療提供了可靠、廉價(jià)、高效方法。 Jonathan等 [105]設(shè)計(jì)了一類陽離子聚合物載體，旨在優(yōu)化直接影響陽離子聚合物載體的轉(zhuǎn)染效率的因素，該復(fù)合物是葉酸、 PEI、和 PEG的接枝共聚物，與基因 pLuc 形成復(fù)合物 folate–PEG–folategraftPEI/pLuc（ FPFgPEI/DNA） ,該復(fù)合物具有突破內(nèi)涵體膜的能力，在轉(zhuǎn)染口腔上皮細(xì)胞 KB、結(jié)腸 CT26 colon adenocarcinoma、肌肉平滑肌細(xì)胞（ SMC）時(shí)，轉(zhuǎn)染效率依賴于細(xì)胞類型， FPFgPEG與 DNA形成電中性納米復(fù)合物時(shí)， MTT分析顯示無毒，轉(zhuǎn)染效率隨復(fù)合物的濃度的增高而升高，形成正電聚合物時(shí)，轉(zhuǎn)染效率隨復(fù)合物的濃度的降低而有所下降。 在 PEI分子 耦聯(lián) 配體 ， 如 乳糖、半乳糖、脫輔基蛋白 E等 [106108]， 可增加載體系統(tǒng)的 靶 向性 ，也可與親 水 基 團(tuán) 的聚合物 如 PEG形成共聚物以提高其水溶性 [109]，從而提高其轉(zhuǎn)染效率。 樹枝狀 大分子 （ dendrimers） 大量的末端官能團(tuán)、緊密且精確控制的分子結(jié)構(gòu)是樹狀大分子所具有的獨(dú)特性質(zhì)，這些特性使其越來越多的被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而應(yīng)用最活躍的一個(gè)領(lǐng)域是作為非病毒類基因載體。樹狀大分子是通過多功能基單體 ABn 逐步重復(fù)反應(yīng)得到的具有樹枝狀高度支化結(jié)構(gòu)的大分子。其分子結(jié)構(gòu)包括三部分：初始核 (氨或乙二胺等 )；枝 (代數(shù) )；末端基團(tuán)，如圖 75。樹狀大分子的大小隨代數(shù)增加而增加。結(jié)構(gòu)規(guī)整、精致、高度對(duì) 稱；分子體積、形狀及功能基種類、數(shù)目都可精確控制；其內(nèi)部具有空腔 ,可以包裹藥物分子，末端基團(tuán)通過修飾可連接基因和抗體等生物活性物質(zhì)，致密的末端基團(tuán)允許每個(gè)樹狀大分子結(jié)合更多的活性物質(zhì) ，形成親脂的、親水的、非離子型的 、 陽離子 的、 陰離子的表面 。 25 圖 75 樹枝狀 大分子的結(jié)構(gòu)特征 樹狀大分子的合成方法 樹狀大分子最早于 80年代初由美國(guó)化學(xué) 家 Tomalia博士發(fā)明。其合成方法有兩種 [110,111]，如圖 76： ① 發(fā)散法（ divergent synthesis method） 它以一個(gè) ABn型（通常 n=2， 3）分子如氨、 1,2乙二胺（ EDA）、丙二胺或氯代苯三甲酸為核心啟始分子，經(jīng)重復(fù)的逐級(jí)聚合反應(yīng)，向四周徑向生長(zhǎng)、加層，最終形成樹枝狀結(jié)構(gòu)。每一次循環(huán)就在已形成的聚合物上添加一層，且表面的 B 基團(tuán)數(shù)倍增，相對(duì)分子質(zhì)量呈指數(shù)增大，直徑按約 1nm 量數(shù)增加，一 層 分子稱為一代（ generation）分子。 ② 會(huì) 聚法（ convergent synthesis method） 它主要涉及兩個(gè)步驟：首先，一系列小分枝反復(fù) 偶合 ，生成兩端具有活性基團(tuán)的樹枝狀結(jié)構(gòu)（ dendron） ， 然后錨定一個(gè)核心分子 ，從而產(chǎn)生一個(gè)由多個(gè) dendron 組成的高度 支 化的樹狀高聚物。 圖 76 樹狀大分子的合成方法 發(fā)散法 合聚法 26 用作基因載體的樹狀大分子其表面要有正電荷以壓縮帶負(fù)電的 DNA，其中， PAMAM 和 PPI 樹狀大分子應(yīng)用最為廣泛。最早用作基因轉(zhuǎn)染的是 PAMAM 樹狀大分子 [110]，一般以 EDA 或氨為核，整代樹狀大分子為氨基末端，半代為帶負(fù)電荷的羧酸鹽末端。 PPI 樹狀大分子以 DAB 為核，以丙烯腈為重復(fù)單元，交替重復(fù)進(jìn)行 Michael 加成反應(yīng)（ N烷基化 ）和多元腈的加氫還原反應(yīng)，獲得樹枝結(jié)構(gòu)的增長(zhǎng) [112]。 樹狀大分子 /DNA 納米復(fù)合物的形成 樹狀大分子與核酸的相互作用的機(jī)理跟其它陽離子聚合物載體的相似：樹狀大分子陽離子末端與基因上帶負(fù)電荷的磷酸酯基團(tuán)之間的靜電引力是復(fù)合物 (dendriplexes) 形成的主要推動(dòng)力 [113]，樹狀物能使 DNA 高度緊縮，可以保護(hù)核酸不被降解， Tang 研究發(fā)現(xiàn)，攜帶幾個(gè) DNA 分子的 PAMAMD /DNA 納米復(fù)合物的粒徑只有 50－ 100nm[114]。 dendrimer與 DNA 形成復(fù)合物時(shí)， dendrimer 中和 DNA 表面的負(fù)電荷，復(fù)合物表面形成網(wǎng)狀的正電荷，隨著正電荷的增加，復(fù)合物表面的理化性質(zhì)和生理行為將發(fā)生變化。增加 Dendrimer/DNA的 N/P 比值在溶液中將形成水溶性不同的不同密度的納米復(fù)合物，電荷密度隨著代數(shù)的增加而增大。當(dāng)比值大于 20 時(shí)，形成的溶于水的低密度的復(fù)合物，實(shí)驗(yàn)證明只有低密度水溶性的復(fù)合物才具有轉(zhuǎn)染能力 [115]。 此外 ， DNA 濃度決定了所形成復(fù)合物形式：當(dāng) DNA 濃度 ≤10ng/mol時(shí)，其與 PMAMAD 形成復(fù)合物懸浮于水 溶液，無沉淀生成。這說明可溶性復(fù)合物含量隨著 PMAMAD/DNA 電荷比遞增 。因此， N/P 比值是影響復(fù)合物比值的關(guān)鍵因素 [116]。 樹狀大分子基因載體的轉(zhuǎn)染作用 樹狀大分子的轉(zhuǎn)染機(jī)制與其它陽離子聚合物類似，樹狀大分子 /DNA納米復(fù)合物表面過剩正電荷能促進(jìn)細(xì)胞的吸附，再通過膜的融合或內(nèi)吞作用將 DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞，形成內(nèi)涵體（ endosome）。 DNA從內(nèi)涵體釋放，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，再進(jìn)一步進(jìn)入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。 Zuhorn 等 [117]研究發(fā)現(xiàn)樹狀大分子 (SuperfectTM) 通過細(xì)胞膜上的脂筏 介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)涵體，這與曾報(bào)道的脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制相同 [118]。 DNA 必須從內(nèi)涵體中脫離出來進(jìn)入細(xì)胞核才能實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，否則將隨著內(nèi)含體進(jìn)入溶酶體而被溶酶體中的核酸酶降解。PPI、 PAMAM 樹狀大分子正是由于載體本身具有高的緩沖能力，起到了“質(zhì)子海綿”的作用，因此能成功的從內(nèi)涵體中逃逸 [119]。 Hong 等 [120]研究發(fā)現(xiàn)，表面帶正電的樹狀大分子會(huì)在胞膜上形成瞬時(shí) 15–40 nm 的小孔，這些孔沒有選擇性，樹狀大分子可以由此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)， 27 胞內(nèi)物質(zhì)也可能由此出胞。 樹狀大分子用作轉(zhuǎn)染試劑有以下幾個(gè)特 點(diǎn)。首先，復(fù)合物具有很高的穩(wěn)定性和溶解性。Delong等 [121]研究發(fā)現(xiàn)樹狀大分子并不改變 DNA的結(jié)構(gòu)，保證復(fù)合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和 DNA的活性。另外復(fù)合物在水溶液中可穩(wěn)定存在長(zhǎng)達(dá)幾周時(shí)間，并且在較大的 pH值范圍內(nèi)和不同的緩沖液中 (水， 500mmol/LNacl， PBS等 )穩(wěn)定存在，并不解離。只有采用離子清潔劑 SDS(十二烷基硫酸鈉 )時(shí)才能解離復(fù)合物 [122]。復(fù)合物對(duì)限制性內(nèi)切酶也很穩(wěn)定，這就使得 DNA在體內(nèi)存活時(shí)間延長(zhǎng)。與裸露的 DNA或現(xiàn)有的陽離子脂質(zhì)體系統(tǒng)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)相比， DNA與樹狀大分子的復(fù)合物可 在體外轉(zhuǎn)染大量不同類型的真核細(xì)胞，并具有普遍的高效性。其次，PAMAM樹狀大分子能緩沖內(nèi)體中的 pH值。熱處理使之活化后由于除去一些分枝而靈活多變，其轉(zhuǎn)染效率提高 50倍左右。由于他們的分支中含有大量氨基，因此可共價(jià)偶聯(lián)一些配體后被迅速內(nèi)吞。最后，對(duì)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的大小與復(fù)合物分子的大小、形狀、表面電荷密度、 pKa (樹狀大分子的酸性解離常數(shù) )及