【正文】 (b) (c) (d) 圖 139 動物細胞圖 a, 胚胎細胞 。 b, 肌肉細胞 。 c, 血液細胞 。 d, 神經細胞 即使在體外培養(yǎng)的動物細胞中實現外源基因轉導，也與細胞種類有很大關系。按照前述的納米載體輸送基因的三種機制，不同的納米基因載體對受體細胞的選擇性是必然的，尤其是前兩種機制。對于受體介導機制而言，帶有特定配基的納米載體只能將基因轉入有相應受體的細胞內；對于吞噬機制而言，納米載體只能將基因輸送到具有吞噬功能的細胞中。對于納米穿膜機制 ，納米載體將對細胞具有更精細的選擇性。細胞膜的流動性、細胞的活力、細胞所處的周期時相等都將影響納米粒子的穿膜作用。因此，納米粒子穿膜進入不同的細胞、同一細胞的不同狀態(tài)時的難易相差很大，從而導致不同的基因轉導效率。 基因轉導與納米粒尺寸的關系 納米基因轉導的應用與納米粒的尺寸有很大的關系。以理想狀態(tài)下的球形顆粒為例，該微粒的表面積與微粒的半徑的平方成正比，微粒的體積與半徑的三次方成正比，故其比表面積（表面積 /體 396 積）與直徑成反比。隨著顆粒直徑變小，比表面積會顯著增大，單位質量的納米材料的總表面積 以及材料所能吸附的質粒數量也隨之顯著增加，結果見表 131。 表 131 不同粒徑的 1 克納米材料（密度為 1 克 /cm3）的總面積 顆粒直徑（ nm） 顆粒體積（ nm3） 單個顆粒表面積（ nm2） 總面積（ nm2） 3 1021 1021 6 1020 3 1020 3 1019 超微顆粒的表 面與大 尺寸 物體的表面是十分不同的，若用高倍率電子顯微鏡對金超微顆粒（直徑為 2x103 微米）進行電視攝像，實時觀察發(fā)現這些顆粒沒有固定的形態(tài)，隨著時間的變化會自動形成各種形狀（如立方體 、 八面體 、 十面體 、 二十面體多晶等），它既不同于一般固體，又不同于液體，是一種準固體。在電子顯微鏡的電子束照射下，表面原子仿佛進入了 “ 沸騰 ” 狀態(tài)，尺寸大于 10 納米后才看不到這種顆粒結構的不穩(wěn)定性，這時微顆粒具有穩(wěn)定的結構狀態(tài)。 對于超微顆粒而言，隨著顆粒尺寸的量變，在一定條件下會引起顆粒性質的質變。一般認為，納米?？梢愿淖兡み\轉 機制，增加生物膜的 通透性 ，有利于 外源基因突破細胞膜的障礙進入細胞內，提高轉導效率。如 在基因槍法基因轉導過程中，使用直徑 600 nm 的金粒作為 DNA 載體時，轉導效率較使用 1200 nm 的金粒時轉導效率大為提高。脂質體介導的基因轉導中，脂質體的大小對轉導效率也會產生十分重要的影響。尺寸較小的脂質體不但具有更大的比表面積，能夠吸附、包裹更多的外源DNA，而且可以大大提高進入受體細胞 DNA 的機率。相反，如果使用大尺寸的脂質體，往往會造成在脂質體與 DNA 形成復合物后脂質體發(fā)生聚集，甚至出現沉淀，最終導致外源基因轉導失 敗。對于基因轉導的之一的基因治療來說， 納米粒的粒徑也是決定其轉導效率和作用時間的重要因素之一，目前認為在構建體內長循環(huán)納米微粒時較好的粒徑尺寸為 200 nm。 按照前述的納米基因轉導三種機制，受體介導機制和穿膜機制必然要求較小的粒徑，尤其是穿膜機制，顯然，納米粒徑越小越容易實現穿膜。 此外納米粒作為基因載體進行基因轉導還具有其它一些顯著的優(yōu)點：納米粒能包裹、濃縮、保護核苷酸，使其免遭核酸酶的降解；具有生物親和性，易于在其表面耦聯特異性的靶向分子，實現基因治療的特異性；在循環(huán)系統(tǒng)中的循環(huán)時間較普通顆粒明顯延長 ，在一定時間內不會象普通顆粒那樣迅速地被吞噬細胞清除，提高了基因轉導如基因治療的效果；讓核苷酸緩慢釋放，有效地延長作用時 397 間，并維持有效的核苷酸濃度，提高轉導效率和轉導產物的生物利用度；代謝產物少，副作用小，無免疫排斥反應等。 基因轉導 與納米粒表面電荷的關系 納米粒的表面電荷影響到納米粒與細胞膜的相互作用，同時也會影響其承載外源 DNA 或 RNA的能力。核酸分子由于帶有負電荷而容易與帶正電荷的載體相結合，因此陽離子載體與陰離子載體相比往往有較大的承載外源 DNA 或 RNA 的能力，有利于提高其轉化 能力。另外，負電荷表面往往使納米粒相對于正電荷或中性表面在體內更易被清除，而中性的表面最適合用于延長納米粒在體內的循環(huán)時間。如最初用作基因載體的脂質體多為天然的陰離子脂質體，質粒 DNA 被包入脂質體內部。其明顯的缺點就是包封率低，而且容易被溶酶體溶解破壞。其后對傳統(tǒng)的陰離子型脂質體進行改進，采用人工合成的陽離子脂質體，并在此體系中加入不帶電荷的中性輔助脂，使得轉導效率大幅度提高。利用納米級高分子聚合物作為載體的基因轉導的研究也表明采用陽離子共聚復合物較為合適，但其中加入非離子型聚合物則可以加強載體對外源 DNA 的保護。對納米粒進行表面修飾時，一般也選用非離子性的表面活性劑。納米粒電荷改性一般采用 納米粒包衣 的方式進行，如 分別用血漿蛋白和血清補體對聚甲基丙烯酸甲酯（ PMMA）納米粒包衣，研究包衣前后 RES 對納米粒的攝取情況 等 。 幾乎所有有關的研究都提到用帶正電荷的基因載體，但在以往的研究中，人們更關注載體帶正電荷對其負載 DNA 的影響，實際上納米粒的帶電狀態(tài)對于納米粒與細胞的相互作用影響也很大。在我們的研究中發(fā)現，當用卵磷脂做膜模型時，同一種納米粒，其表面電荷向正方向改變更有利于納米粒進入膜囊泡，而且對于所研究的三種納 米粒均有相同結論。細胞膜上磷脂是主要成分，而磷脂中又以帶負電荷的成分居多，因此，細胞膜表面的基團帶負電荷的較多，從而導致具有正電性的納米粒更易靠近。據報道，帶正電荷的硅納米粒由于負載較多 DNA 而使納米粒與外源 DNA 的復合體帶電狀態(tài)成為負電性，此時該復合體雖然仍能轉導受體細胞，但其轉導效率低于當復合體帶狀態(tài)為正電性時的轉導效率 [49]。因此在納米粒與細胞相互作用時，納米粒的正電狀態(tài)也是有利的。同時，我們也注意到，作為藥物載體的納米顆粒一般不帶電荷或帶有負電荷，許多這樣的納米粒也能夠進入細胞，因此，納米粒進入細 胞時其表面荷電狀態(tài)與其被細胞的吸收能力之間的關系有待進一步研究。 基因轉導與納米粒其它性能及其它因素的關系 用于基因轉導的納米載體的其它物理、化學、生物及結構等方面的性能對于成功的實現轉導也會產生影響。采用基因槍法進行外源基因轉導時，如何進一步提高納米載體的密度，增加其穿透細胞壁時所具有的動量就是一個十分重要的問題。對于許多納米基因載體來說，將其制成合適的結構對于 398 提高基因轉化效率也是至關重要的。一般來說，疏松多孔的納米結構能夠結合或吸附更多的外源基因，同時由于其空間效應的存在，也能使其成為外 源基因抵抗核酸酶分解的天然屏障。 通過對現有的納米載體進行改性，特別是化學改性目前已成為納米基因轉導技術中的一個研究熱點。研究表明通過改變現有脂質體組成，將其制成 pH 敏感型脂質體，其轉導鼠 LtK細胞的效率提高 8 倍。根據某些腫瘤部位的溫度高于正常體溫的特點，制成溫度敏感型靶向脂質體，將外源基因特異性地運輸至靶細胞中，基因治療效果明顯提高。通過改變載體的親水或疏水特性，改變其與外源DNA 分子結合能力及結合狀態(tài)，也將對基因轉導效率產生影響。另外，可以在載體制備時有意識地引入一些能與 DNA 分子結合的蛋白，形成 DNA 多肽復合物，或引入抑制核酸酶活力的基團，使其抵抗核酸酶降解。 目前用于惡性腫瘤進行基因治療的載體主要由金屬納米粒、無機非金屬納米粒、生物降解性高分子納米粒和生物性顆粒構成。由于毒副作用少，膠體金是金屬材料中作為基因載體的重要材料。膠體金于 40 年前用于細胞器官染色，以便在電鏡下對細胞分子進行觀察與分析。膠體金對細胞外基質膠原蛋白表現出特異結合的特性，啟發(fā)人們考慮用膠體金作為基因的載體，用于惡性腫瘤的 基因 治療。 在非金屬無機材料中，磁性納米材料最為引人注目，已成為目前新興生物材料領域的研究熱點。特別是磁性納米 顆粒表現出良好的表面效應，比表面激增，官能團密度和選擇吸附能力變大，攜帶基因的數量增加，加之其具有良好的靶向性，這些都將對提高腫瘤部位外源基因的濃度及轉化效率，最終增強治療效果產生重要的作用。 除上述一些因素影響外，外源基因的種類、受體材料的特性、基因轉導的方法等均會對納米基因轉導產生一定的影響。如植物受生長季節(jié)和很多環(huán)境條件因素的影響，如溫度、濕度、光照等；動物轉基因除受載體，受體細胞類型及操作方法的影響外， 還與動物的種類、年齡、取材部位等有關， 特別是法律及倫理道德的約束， 還有轉基因的安全等問題。 基因轉導可能與納米載體的形狀有關，比如針狀的納米?？赡芫哂懈叩霓D導效率。但在考慮不同形狀載體的轉導效率時應該同時考慮其對細胞壁 /膜的穿透能力、對細胞的損傷程度、其所能攜帶及有效進入細胞的外源 DNA 數量等因素。 展望 雖然納米基因轉導已經取得了一定的成功，如已經成功的應用納米材料實現了目標基因在受體細胞中的轉化、整合及表達，但是目前對基因和質粒的操作主要還是通過限制性內切酶的作用來實現的。由于現有的限制性內切酶數量有限，加之因其堿基識別模式而造成其在基因操作過程中還具有一 399 定的盲目性，故此還未能 實現真正意義上精確地對單個核苷酸和核苷酸組分的直接操作，以達到精確地研究基因結構與功能的目的。隨著納米科學的進步、納米學研究的不斷深入和發(fā)展，直接對單個原子、分子及其組成部分進行操作將成為一項經濟、實用的技術而得到廣泛的應用。那時，人們將能夠借助納米技術的幫助，按照自己的意愿對基因進行精準操作。 基因轉導主要是以質粒的形式進行，因此如何能夠快速、高效地構建及復制出大量的質粒就成為基因轉導過程能否順利進行的最主要的制約因素之一。目前質粒的構建是通過限制性內切酶和連接酶等現代分子生物學手段完成，質粒的大量擴增則 是通過細菌的大量培養(yǎng)和繁殖來實現。而應用細菌擴增質粒雖然能夠實現質粒擴增的目的，但由于通過細菌擴增質粒本身就是一個間接的過程，同時又必須考慮因細菌基因及其產物影響所擴增的質粒而導致的對此后的遺傳轉化造成的潛在負面影響，因此如果能夠應用納米技術實現對質粒進行精確可控的構建，并在此基礎上實現其直接、快速的大量擴增，將為高效的基因轉導提供充足的、高質量的目的基因來源。同時，還可以通過納米技術改變質粒的存在形式，以提高基因轉化的效率。目前質粒的存在形式有線狀、環(huán)狀、超螺旋狀及介于以上三種類型之間的形式，今后則可以通 過納米技術進一步減小質粒的體積，增加其密度。這樣一來，一方面可以提高攜帶外源基因的質粒進入受體細胞的數量，另一方面也能促進受體細胞染色體 DNA 或質體DNA 對外源基因的整合，最終提高外源基因正確功能表達的效率。 基因轉導的輔助元件是整個基因轉導過程中非常重要的一個環(huán)節(jié)。目前用于轉導的主要輔助元件為金粒、脂質體、高分子復合材料等物理、生物及化學的納米材料，這些輔助元件都已經成功地轉導了目的基因。但目前使用的這些輔助元件還存在著轉化效率低、價格昂貴、制備困難等缺點。隨著納米技術的發(fā)展，一方面可以大量制備廉價的納米 級的輔助元件，為外源基因的遺傳轉化提供新的載體，另一方面可以對現有的載體進行改進，進一步減小其總體尺寸，在增加其比表面積的同時提高其吸附外源 DNA 的能力，以提高其轉化效率。另外可以通過納米技術實現對載體的改造，增強載體對外源 DNA 的屏蔽作用，以降低核酸酶對外源 DNA 的降解，并能使外源基因在較長的時間內持續(xù)發(fā)揮作用。 納米轉基因技術，取得了一定的成就。但是它和其他技術一樣，也被基因安全問題所困擾，基因安全問題包括了轉基因產品安全問題（轉基因食品安全，轉基因藥物安全），以及基因環(huán)境安全問題等。不僅困擾著轉基因產 品的市場推廣，也限制著新的轉基因產品的開發(fā)。這些方面的問題都正在由人們用改進的轉基因技術解決。 科學家們已經設想，用基因芯片、蛋白質芯片組裝成 “ 納米機器人 ” ，攜帶 DNA 去更換或修復有缺陷的基因片段 ， 這種技術仍處于研制初期，但將來 則 有可能完成在人體細胞內發(fā)放藥物等醫(yī)療任務 [68]。 400 參考文獻 1 Massiah A, Rong H L, Brown S, et al. 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