【正文】 (b) (c) (d) 圖 139 動(dòng)物細(xì)胞圖 a, 胚胎細(xì)胞 。 b, 肌肉細(xì)胞 。 c, 血液細(xì)胞 。 d, 神經(jīng)細(xì)胞 即使在體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，也與細(xì)胞種類(lèi)有很大關(guān)系。按照前述的納米載體輸送基因的三種機(jī)制，不同的納米基因載體對(duì)受體細(xì)胞的選擇性是必然的，尤其是前兩種機(jī)制。對(duì)于受體介導(dǎo)機(jī)制而言，帶有特定配基的納米載體只能將基因轉(zhuǎn)入有相應(yīng)受體的細(xì)胞內(nèi)；對(duì)于吞噬機(jī)制而言，納米載體只能將基因輸送到具有吞噬功能的細(xì)胞中。對(duì)于納米穿膜機(jī)制 ，納米載體將對(duì)細(xì)胞具有更精細(xì)的選擇性。細(xì)胞膜的流動(dòng)性、細(xì)胞的活力、細(xì)胞所處的周期時(shí)相等都將影響納米粒子的穿膜作用。因此，納米粒子穿膜進(jìn)入不同的細(xì)胞、同一細(xì)胞的不同狀態(tài)時(shí)的難易相差很大，從而導(dǎo)致不同的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與納米粒尺寸的關(guān)系 納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的應(yīng)用與納米粒的尺寸有很大的關(guān)系。以理想狀態(tài)下的球形顆粒為例，該微粒的表面積與微粒的半徑的平方成正比，微粒的體積與半徑的三次方成正比，故其比表面積（表面積 /體 396 積）與直徑成反比。隨著顆粒直徑變小，比表面積會(huì)顯著增大，單位質(zhì)量的納米材料的總表面積 以及材料所能吸附的質(zhì)粒數(shù)量也隨之顯著增加，結(jié)果見(jiàn)表 131。 表 131 不同粒徑的 1 克納米材料（密度為 1 克 /cm3）的總面積 顆粒直徑（ nm） 顆粒體積（ nm3） 單個(gè)顆粒表面積（ nm2） 總面積（ nm2） 3 1021 1021 6 1020 3 1020 3 1019 超微顆粒的表 面與大 尺寸 物體的表面是十分不同的，若用高倍率電子顯微鏡對(duì)金超微顆粒（直徑為 2x103 微米）進(jìn)行電視攝像，實(shí)時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)這些顆粒沒(méi)有固定的形態(tài)，隨著時(shí)間的變化會(huì)自動(dòng)形成各種形狀（如立方體 、 八面體 、 十面體 、 二十面體多晶等），它既不同于一般固體，又不同于液體，是一種準(zhǔn)固體。在電子顯微鏡的電子束照射下，表面原子仿佛進(jìn)入了 “ 沸騰 ” 狀態(tài)，尺寸大于 10 納米后才看不到這種顆粒結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，這時(shí)微顆粒具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。 對(duì)于超微顆粒而言，隨著顆粒尺寸的量變，在一定條件下會(huì)引起顆粒性質(zhì)的質(zhì)變。一般認(rèn)為，納米粒可以改變膜運(yùn)轉(zhuǎn) 機(jī)制，增加生物膜的 通透性 ，有利于 外源基因突破細(xì)胞膜的障礙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。如 在基因槍法基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，使用直徑 600 nm 的金粒作為 DNA 載體時(shí)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較使用 1200 nm 的金粒時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率大為提高。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)中，脂質(zhì)體的大小對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也會(huì)產(chǎn)生十分重要的影響。尺寸較小的脂質(zhì)體不但具有更大的比表面積，能夠吸附、包裹更多的外源DNA，而且可以大大提高進(jìn)入受體細(xì)胞 DNA 的機(jī)率。相反，如果使用大尺寸的脂質(zhì)體，往往會(huì)造成在脂質(zhì)體與 DNA 形成復(fù)合物后脂質(zhì)體發(fā)生聚集，甚至出現(xiàn)沉淀，最終導(dǎo)致外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)失 敗。對(duì)于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的之一的基因治療來(lái)說(shuō)， 納米粒的粒徑也是決定其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和作用時(shí)間的重要因素之一，目前認(rèn)為在構(gòu)建體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)納米微粒時(shí)較好的粒徑尺寸為 200 nm。 按照前述的納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)三種機(jī)制，受體介導(dǎo)機(jī)制和穿膜機(jī)制必然要求較小的粒徑，尤其是穿膜機(jī)制，顯然，納米粒徑越小越容易實(shí)現(xiàn)穿膜。 此外納米粒作為基因載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)還具有其它一些顯著的優(yōu)點(diǎn)：納米粒能包裹、濃縮、保護(hù)核苷酸，使其免遭核酸酶的降解；具有生物親和性，易于在其表面耦聯(lián)特異性的靶向分子，實(shí)現(xiàn)基因治療的特異性；在循環(huán)系統(tǒng)中的循環(huán)時(shí)間較普通顆粒明顯延長(zhǎng) ，在一定時(shí)間內(nèi)不會(huì)象普通顆粒那樣迅速地被吞噬細(xì)胞清除，提高了基因轉(zhuǎn)導(dǎo)如基因治療的效果；讓核苷酸緩慢釋放，有效地延長(zhǎng)作用時(shí) 397 間，并維持有效的核苷酸濃度，提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)物的生物利用度；代謝產(chǎn)物少，副作用小，無(wú)免疫排斥反應(yīng)等。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo) 與納米粒表面電荷的關(guān)系 納米粒的表面電荷影響到納米粒與細(xì)胞膜的相互作用，同時(shí)也會(huì)影響其承載外源 DNA 或 RNA的能力。核酸分子由于帶有負(fù)電荷而容易與帶正電荷的載體相結(jié)合，因此陽(yáng)離子載體與陰離子載體相比往往有較大的承載外源 DNA 或 RNA 的能力，有利于提高其轉(zhuǎn)化 能力。另外，負(fù)電荷表面往往使納米粒相對(duì)于正電荷或中性表面在體內(nèi)更易被清除，而中性的表面最適合用于延長(zhǎng)納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。如最初用作基因載體的脂質(zhì)體多為天然的陰離子脂質(zhì)體，質(zhì)粒 DNA 被包入脂質(zhì)體內(nèi)部。其明顯的缺點(diǎn)就是包封率低，而且容易被溶酶體溶解破壞。其后對(duì)傳統(tǒng)的陰離子型脂質(zhì)體進(jìn)行改進(jìn)，采用人工合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，并在此體系中加入不帶電荷的中性輔助脂，使得轉(zhuǎn)導(dǎo)效率大幅度提高。利用納米級(jí)高分子聚合物作為載體的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究也表明采用陽(yáng)離子共聚復(fù)合物較為合適，但其中加入非離子型聚合物則可以加強(qiáng)載體對(duì)外源 DNA 的保護(hù)。對(duì)納米粒進(jìn)行表面修飾時(shí)，一般也選用非離子性的表面活性劑。納米粒電荷改性一般采用 納米粒包衣 的方式進(jìn)行，如 分別用血漿蛋白和血清補(bǔ)體對(duì)聚甲基丙烯酸甲酯（ PMMA）納米粒包衣，研究包衣前后 RES 對(duì)納米粒的攝取情況 等 。 幾乎所有有關(guān)的研究都提到用帶正電荷的基因載體，但在以往的研究中，人們更關(guān)注載體帶正電荷對(duì)其負(fù)載 DNA 的影響，實(shí)際上納米粒的帶電狀態(tài)對(duì)于納米粒與細(xì)胞的相互作用影響也很大。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用卵磷脂做膜模型時(shí)，同一種納米粒，其表面電荷向正方向改變更有利于納米粒進(jìn)入膜囊泡，而且對(duì)于所研究的三種納 米粒均有相同結(jié)論。細(xì)胞膜上磷脂是主要成分，而磷脂中又以帶負(fù)電荷的成分居多，因此，細(xì)胞膜表面的基團(tuán)帶負(fù)電荷的較多，從而導(dǎo)致具有正電性的納米粒更易靠近。據(jù)報(bào)道，帶正電荷的硅納米粒由于負(fù)載較多 DNA 而使納米粒與外源 DNA 的復(fù)合體帶電狀態(tài)成為負(fù)電性，此時(shí)該復(fù)合體雖然仍能轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞，但其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低于當(dāng)復(fù)合體帶狀態(tài)為正電性時(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 [49]。因此在納米粒與細(xì)胞相互作用時(shí)，納米粒的正電狀態(tài)也是有利的。同時(shí)，我們也注意到，作為藥物載體的納米顆粒一般不帶電荷或帶有負(fù)電荷，許多這樣的納米粒也能夠進(jìn)入細(xì)胞，因此，納米粒進(jìn)入細(xì) 胞時(shí)其表面荷電狀態(tài)與其被細(xì)胞的吸收能力之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與納米粒其它性能及其它因素的關(guān)系 用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的納米載體的其它物理、化學(xué)、生物及結(jié)構(gòu)等方面的性能對(duì)于成功的實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)也會(huì)產(chǎn)生影響。采用基因槍法進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，如何進(jìn)一步提高納米載體的密度，增加其穿透細(xì)胞壁時(shí)所具有的動(dòng)量就是一個(gè)十分重要的問(wèn)題。對(duì)于許多納米基因載體來(lái)說(shuō)，將其制成合適的結(jié)構(gòu)對(duì)于 398 提高基因轉(zhuǎn)化效率也是至關(guān)重要的。一般來(lái)說(shuō)，疏松多孔的納米結(jié)構(gòu)能夠結(jié)合或吸附更多的外源基因，同時(shí)由于其空間效應(yīng)的存在，也能使其成為外 源基因抵抗核酸酶分解的天然屏障。 通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的納米載體進(jìn)行改性，特別是化學(xué)改性目前已成為納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。研究表明通過(guò)改變現(xiàn)有脂質(zhì)體組成，將其制成 pH 敏感型脂質(zhì)體，其轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠 LtK細(xì)胞的效率提高 8 倍。根據(jù)某些腫瘤部位的溫度高于正常體溫的特點(diǎn)，制成溫度敏感型靶向脂質(zhì)體，將外源基因特異性地運(yùn)輸至靶細(xì)胞中，基因治療效果明顯提高。通過(guò)改變載體的親水或疏水特性，改變其與外源DNA 分子結(jié)合能力及結(jié)合狀態(tài)，也將對(duì)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率產(chǎn)生影響。另外，可以在載體制備時(shí)有意識(shí)地引入一些能與 DNA 分子結(jié)合的蛋白，形成 DNA 多肽復(fù)合物，或引入抑制核酸酶活力的基團(tuán)，使其抵抗核酸酶降解。 目前用于惡性腫瘤進(jìn)行基因治療的載體主要由金屬納米粒、無(wú)機(jī)非金屬納米粒、生物降解性高分子納米粒和生物性顆粒構(gòu)成。由于毒副作用少，膠體金是金屬材料中作為基因載體的重要材料。膠體金于 40 年前用于細(xì)胞器官染色，以便在電鏡下對(duì)細(xì)胞分子進(jìn)行觀察與分析。膠體金對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白表現(xiàn)出特異結(jié)合的特性，啟發(fā)人們考慮用膠體金作為基因的載體，用于惡性腫瘤的 基因 治療。 在非金屬無(wú)機(jī)材料中，磁性納米材料最為引人注目，已成為目前新興生物材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。特別是磁性納米 顆粒表現(xiàn)出良好的表面效應(yīng)，比表面激增，官能團(tuán)密度和選擇吸附能力變大，攜帶基因的數(shù)量增加，加之其具有良好的靶向性，這些都將對(duì)提高腫瘤部位外源基因的濃度及轉(zhuǎn)化效率，最終增強(qiáng)治療效果產(chǎn)生重要的作用。 除上述一些因素影響外，外源基因的種類(lèi)、受體材料的特性、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法等均會(huì)對(duì)納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生一定的影響。如植物受生長(zhǎng)季節(jié)和很多環(huán)境條件因素的影響，如溫度、濕度、光照等；動(dòng)物轉(zhuǎn)基因除受載體，受體細(xì)胞類(lèi)型及操作方法的影響外， 還與動(dòng)物的種類(lèi)、年齡、取材部位等有關(guān)， 特別是法律及倫理道德的約束， 還有轉(zhuǎn)基因的安全等問(wèn)題。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可能與納米載體的形狀有關(guān)，比如針狀的納米?？赡芫哂懈叩霓D(zhuǎn)導(dǎo)效率。但在考慮不同形狀載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率時(shí)應(yīng)該同時(shí)考慮其對(duì)細(xì)胞壁 /膜的穿透能力、對(duì)細(xì)胞的損傷程度、其所能攜帶及有效進(jìn)入細(xì)胞的外源 DNA 數(shù)量等因素。 展望 雖然納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)已經(jīng)取得了一定的成功，如已經(jīng)成功的應(yīng)用納米材料實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因在受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化、整合及表達(dá)，但是目前對(duì)基因和質(zhì)粒的操作主要還是通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由于現(xiàn)有的限制性?xún)?nèi)切酶數(shù)量有限，加之因其堿基識(shí)別模式而造成其在基因操作過(guò)程中還具有一 399 定的盲目性，故此還未能 實(shí)現(xiàn)真正意義上精確地對(duì)單個(gè)核苷酸和核苷酸組分的直接操作，以達(dá)到精確地研究基因結(jié)構(gòu)與功能的目的。隨著納米科學(xué)的進(jìn)步、納米學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，直接對(duì)單個(gè)原子、分子及其組成部分進(jìn)行操作將成為一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的技術(shù)而得到廣泛的應(yīng)用。那時(shí)，人們將能夠借助納米技術(shù)的幫助，按照自己的意愿對(duì)基因進(jìn)行精準(zhǔn)操作。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是以質(zhì)粒的形式進(jìn)行，因此如何能夠快速、高效地構(gòu)建及復(fù)制出大量的質(zhì)粒就成為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程能否順利進(jìn)行的最主要的制約因素之一。目前質(zhì)粒的構(gòu)建是通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶和連接酶等現(xiàn)代分子生物學(xué)手段完成，質(zhì)粒的大量擴(kuò)增則 是通過(guò)細(xì)菌的大量培養(yǎng)和繁殖來(lái)實(shí)現(xiàn)。而應(yīng)用細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒雖然能夠?qū)崿F(xiàn)質(zhì)粒擴(kuò)增的目的，但由于通過(guò)細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒本身就是一個(gè)間接的過(guò)程，同時(shí)又必須考慮因細(xì)菌基因及其產(chǎn)物影響所擴(kuò)增的質(zhì)粒而導(dǎo)致的對(duì)此后的遺傳轉(zhuǎn)化造成的潛在負(fù)面影響，因此如果能夠應(yīng)用納米技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行精確可控的構(gòu)建，并在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)其直接、快速的大量擴(kuò)增，將為高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)提供充足的、高質(zhì)量的目的基因來(lái)源。同時(shí)，還可以通過(guò)納米技術(shù)改變質(zhì)粒的存在形式，以提高基因轉(zhuǎn)化的效率。目前質(zhì)粒的存在形式有線狀、環(huán)狀、超螺旋狀及介于以上三種類(lèi)型之間的形式，今后則可以通 過(guò)納米技術(shù)進(jìn)一步減小質(zhì)粒的體積，增加其密度。這樣一來(lái)，一方面可以提高攜帶外源基因的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞的數(shù)量，另一方面也能促進(jìn)受體細(xì)胞染色體 DNA 或質(zhì)體DNA 對(duì)外源基因的整合，最終提高外源基因正確功能表達(dá)的效率。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的輔助元件是整個(gè)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。目前用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要輔助元件為金粒、脂質(zhì)體、高分子復(fù)合材料等物理、生物及化學(xué)的納米材料，這些輔助元件都已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)導(dǎo)了目的基因。但目前使用的這些輔助元件還存在著轉(zhuǎn)化效率低、價(jià)格昂貴、制備困難等缺點(diǎn)。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，一方面可以大量制備廉價(jià)的納米 級(jí)的輔助元件，為外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化提供新的載體，另一方面可以對(duì)現(xiàn)有的載體進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)一步減小其總體尺寸，在增加其比表面積的同時(shí)提高其吸附外源 DNA 的能力，以提高其轉(zhuǎn)化效率。另外可以通過(guò)納米技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)載體的改造，增強(qiáng)載體對(duì)外源 DNA 的屏蔽作用，以降低核酸酶對(duì)外源 DNA 的降解，并能使外源基因在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用。 納米轉(zhuǎn)基因技術(shù)，取得了一定的成就。但是它和其他技術(shù)一樣，也被基因安全問(wèn)題所困擾，基因安全問(wèn)題包括了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全問(wèn)題（轉(zhuǎn)基因食品安全，轉(zhuǎn)基因藥物安全），以及基因環(huán)境安全問(wèn)題等。不僅困擾著轉(zhuǎn)基因產(chǎn) 品的市場(chǎng)推廣，也限制著新的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。這些方面的問(wèn)題都正在由人們用改進(jìn)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)解決。 科學(xué)家們已經(jīng)設(shè)想，用基因芯片、蛋白質(zhì)芯片組裝成 “ 納米機(jī)器人 ” ，攜帶 DNA 去更換或修復(fù)有缺陷的基因片段 ， 這種技術(shù)仍處于研制初期，但將來(lái) 則 有可能完成在人體細(xì)胞內(nèi)發(fā)放藥物等醫(yī)療任務(wù) [68]。 400 參考文獻(xiàn) 1 Massiah A, Rong H L, Brown S, et al. 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