【正文】 狀態(tài)下射入受體細(xì)胞中的一種遺傳物質(zhì)在物種間或物種內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)。現(xiàn)在，主要的禾谷類作物，如水稻、玉米、小麥 [15]和大麥等， 376 都已通過(guò)基因槍法進(jìn)行了成功的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并得到目的基因正確表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。 選擇劑是區(qū)分轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體的快速有效的手段，因此選擇合適的選擇劑及濃度是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵因素之一。在進(jìn)行植物基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，為了提高轉(zhuǎn)化效率，應(yīng)用納米技術(shù)已將金粒的直徑從約 微米降至 微米以下，使之成為納米粒。正是由于以上的優(yōu)點(diǎn)，基因槍法已經(jīng)成為目前得到廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)化方法之一。 圖 131 DNA 顯微注射模式圖 [22] 以轉(zhuǎn)基因小鼠為例，首先是使供體雌鼠超量排卵，增加用于微注射接種的 DNA 的卵細(xì)胞數(shù)量。幼鼠出生后，可取其尾抽提 DNA，進(jìn)行外源基因的 PCR 檢測(cè)和 Southern 雜交來(lái)確證是否為轉(zhuǎn)基因鼠。盡管如此，由于該方法是直接對(duì)基因進(jìn)行操作，且整合效率高，因此仍是目前獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物極為重要的方法之一。 2．磷酸鈣介導(dǎo)法 磷酸鈣介導(dǎo)法是目前真核細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的最常用方法，其原理是利用 DNA 與磷酸鈣形成的抗 DNA酶的羥基 磷酸鈣復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)熱沖擊處理后促進(jìn)細(xì)胞對(duì)外源 DNA 的吸收。在眾多的因素中，除質(zhì)粒外其余因素均易控制及量化。同時(shí)該方法還能有效地去除殘余的 RNA，以消除 RNA對(duì) DNA 遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)的不利影響。由于野生型 Ti和 Ri 質(zhì)粒的邊界序列之間的 DNA 并不參與轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，因此可以 將其替換為外源基因。這樣，目的基因就能很容易地構(gòu)建到這個(gè)雙元載體上，轉(zhuǎn)入并保持在農(nóng)桿菌中，然后轉(zhuǎn)入植物中。如圖 132 所示，脂質(zhì)體的這種結(jié)構(gòu)使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩親的外源物質(zhì)。最初用作基因載體的脂質(zhì)體是由天然磷脂如卵磷脂、腦磷脂及膽固醇所構(gòu)成的中性或帶陰離子電荷的陰離子脂質(zhì)體，使用時(shí)將質(zhì)粒 DNA 包入脂質(zhì)體內(nèi)部，但包封率較低，因而容易被溶酶體溶解破壞。 DOPE 是一種最 重要的輔助脂。 脂質(zhì)體介導(dǎo) DNA 進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制目前尚不十分清楚。電穿孔的脈沖參數(shù)和過(guò)程容易控制，強(qiáng)度適當(dāng)?shù)碾娒}沖不會(huì)使 DNA 和受體細(xì)胞受到任何損害，因此電擊法是一種很有前途的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。細(xì)胞在緩沖液中懸浮，好像是一種絕緣的由雙面含有水溶液的細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)，施加電場(chǎng)后則會(huì)使細(xì)胞膜上的電荷分離，于是產(chǎn)生了橫跨膜的電位差，異性電荷在細(xì)胞膜上相互吸引，使細(xì)胞膜變薄，在某一臨界電場(chǎng)強(qiáng)度下，引起細(xì)胞膜的破裂和氣孔的形成，使遺傳基因轉(zhuǎn)移到細(xì) 胞中去。 ES 細(xì)胞在 無(wú)飼養(yǎng)層的平板中培養(yǎng)會(huì)持續(xù)分化成肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種專門(mén)功能的細(xì)胞，只有在含有成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層或含有白血病抑制因子的飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)時(shí)才能保持其未分化狀態(tài)并保持 ES 細(xì)胞的潛在分化能力。通常采用一種叫正 負(fù)選擇 384 的策略來(lái)富集整合正確的 ES 細(xì)胞，即首先用正選擇的方法挑選所用整合 DNA 的 ES 細(xì)胞，再用負(fù)選擇方法淘汰整合錯(cuò)誤的細(xì)胞?；驑尫ǖ膶?shí)質(zhì)是納米或微米級(jí)的子彈荷載 DNA 分子，以高速穿透細(xì)胞膜，從而將 DNA 分子運(yùn)載進(jìn)入細(xì)胞染色體 DNA 中。另一種系統(tǒng)是脂質(zhì)體介導(dǎo)的 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，其特點(diǎn)為轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、毒性小、無(wú)潛在感染及能使目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到特定組織等。他們認(rèn)為，這種方法可以用于大通量基因功能篩 選 [46]。采用共聚物作為轉(zhuǎn)導(dǎo)載體時(shí)， DNA 的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較采用單聚物時(shí)高，并在一定范圍內(nèi)共聚物中 HPMA 的含量提高有利于 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的 提高 [48]。把抗 JLI 單克隆抗體連接于多糖修 飾的 PLL 上再與 DNA 復(fù)合所形成的三元復(fù)合物，具有對(duì)含有該抗原的未成熟的皮質(zhì)胸腺細(xì)胞的靶向性，可以用于白血病的治 療 [52]。近來(lái)，發(fā)現(xiàn)樹(shù)狀細(xì)胞在注入了來(lái)自腫瘤細(xì)胞的 RNA 后能夠合成腫瘤特異性抗 原 [57]，該發(fā) 現(xiàn)為人類癌癥的免疫治療提供了一條新的 途徑 [58]。進(jìn)一步將轉(zhuǎn)導(dǎo)后的樹(shù)狀細(xì)胞與類 NK(natural killerlike)的 T 細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，最終使 T 細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)腫瘤的免疫性。魚(yú)精蛋白與寡核苷酸也可形成納米粒子，當(dāng)兩者以適當(dāng)比例復(fù)合時(shí)，核酸酶對(duì)寡核苷酸的水解幾乎完全檢測(cè)不到 ，這種納米粒在 37℃時(shí)可以進(jìn)入細(xì)胞，并定位于胞漿和核中，而在 4℃時(shí)未能發(fā)現(xiàn)其進(jìn)入 細(xì)胞 [66]。這是因?yàn)?，一方面納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)利用納米級(jí)的載體攜帶外源基因，以實(shí)現(xiàn)或促進(jìn)靶細(xì)胞對(duì)外源基因的吸收，達(dá)到基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的目的；另一方面基因轉(zhuǎn)導(dǎo)外源 DNA 的過(guò)程因其所涉及的材料及操作的結(jié)果均為納米級(jí)，所以大多數(shù)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)本身也屬于廣義的納米技術(shù)應(yīng)用范疇 。依據(jù)上述實(shí)例，直接利用核糖核酸或脫氧核糖核酸制備出基因轉(zhuǎn)導(dǎo)材料染色體、 DNA，或者定向改造目的基因，使人們能按照自己的意愿構(gòu)建 基因，為基因轉(zhuǎn) 導(dǎo)技術(shù)開(kāi)辟了廣闊的發(fā)展空間 [68,69]。這些極其微細(xì)的分子結(jié)構(gòu)的特征尺寸大多在 ~100nm 之間，屬于納米尺度范圍。如一個(gè) DNA 堿基對(duì)的長(zhǎng)度約為 nm；一個(gè)基因按 1000 bp 來(lái)算，長(zhǎng)度約為 300 nm；常用質(zhì)粒載體約 4kb~6 kb， 直線長(zhǎng)度約為 1200nm~1600 nm，但因?yàn)橘|(zhì)粒通常為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)推算其直徑應(yīng)為 382nm~573 nm，也是典型的納米顆粒。 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)是由兩條磷酸核糖主鏈相互纏繞形成?？茖W(xué)家們已經(jīng)對(duì)幾個(gè)重要物種如大腸桿菌、酵母、單子葉植物水稻、雙子葉植物擬南芥及人的整個(gè)基因組進(jìn)行了序列測(cè)定。 2022 年 2 月 12 日，由美、中、日、德、英、法等 6 個(gè)國(guó)家參加的人類基因組計(jì)劃和美國(guó)塞萊拉公司（ Celera Genomics，CRA）聯(lián)合公布了人類基因組圖譜及初步分析的結(jié)果。第 22 號(hào)染色體是人體 23 對(duì)染色體中第二小的染色體，共有3 350 萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)，并構(gòu)成了 679 個(gè)基因，其中最長(zhǎng)的一個(gè) DNA 的片段有 2 300 萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)。 目前許多研究證實(shí)，有多種納米?？梢赃M(jìn)入細(xì)胞，然而對(duì)納米粒是怎樣進(jìn)入細(xì)胞的這一問(wèn)題的研究相當(dāng)貧乏，而關(guān)于納米粒又是怎樣攜帶 DNA 進(jìn)入細(xì)胞的研究則更少?？傊?，目前一般認(rèn)為納米粒進(jìn)入細(xì)胞是受體依賴性的，或者是吞噬功能依賴性的。因此，需要對(duì)外源基因納米粒載體與 DNA 的結(jié)合或復(fù)合方式進(jìn)行 研究，從而實(shí)現(xiàn)高效率的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于原核細(xì)胞具有一層由肽聚糖與脂多糖、蛋白質(zhì)構(gòu)成的堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，因此阻止著外源基因的導(dǎo)入。水稻的組織培養(yǎng)相對(duì)比較容易，被稱為禾谷類作物的組織和基因工程的模式植物，而小麥的組織培養(yǎng)則要困難得多，但通過(guò)改善培養(yǎng)條件，也能獲得較高的遺傳轉(zhuǎn)化頻率，可達(dá) 2%。理論上來(lái)講，目的基因要表達(dá)并能穩(wěn)定地遺傳，必須使它整合到受體細(xì)胞的核 DNA 上，如果納米載體能將目的基因送入細(xì)胞核內(nèi)，效果會(huì)更佳。 c, 血液細(xì)胞 。以理想狀態(tài)下的球形顆粒為例，該微粒的表面積與微粒的半徑的平方成正比，微粒的體積與半徑的三次方成正比，故其比表面積（表面積 /體 396 積）與直徑成反比。尺寸較小的脂質(zhì)體不但具有更大的比表面積，能夠吸附、包裹更多的外源DNA，而且可以大大提高進(jìn)入受體細(xì)胞 DNA 的機(jī)率。如最初用作基因載體的脂質(zhì)體多為天然的陰離子脂質(zhì)體，質(zhì)粒 DNA 被包入脂質(zhì)體內(nèi)部。細(xì)胞膜上磷脂是主要成分，而磷脂中又以帶負(fù)電荷的成分居多，因此，細(xì)胞膜表面的基團(tuán)帶負(fù)電荷的較多，從而導(dǎo)致具有正電性的納米粒更易靠近。 通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的納米載體進(jìn)行改性，特別是化學(xué)改性目前已成為納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。膠體金對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白表現(xiàn)出特異結(jié)合的特性，啟發(fā)人們考慮用膠體金作為基因的載體，用于惡性腫瘤的 基因 治療。由于現(xiàn)有的限制性內(nèi)切酶數(shù)量有限，加之因其堿基識(shí)別模式而造成其在基因操作過(guò)程中還具有一 399 定的盲目性，故此還未能 實(shí)現(xiàn)真正意義上精確地對(duì)單個(gè)核苷酸和核苷酸組分的直接操作，以達(dá)到精確地研究基因結(jié)構(gòu)與功能的目的。這樣一來(lái)，一方面可以提高攜帶外源基因的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞的數(shù)量，另一方面也能促進(jìn)受體細(xì)胞染色體 DNA 或質(zhì)體DNA 對(duì)外源基因的整合，最終提高外源基因正確功能表達(dá)的效率。不僅困擾著轉(zhuǎn)基因產(chǎn) 品的市場(chǎng)推廣，也限制著新的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。 科學(xué)家們已經(jīng)設(shè)想，用基因芯片、蛋白質(zhì)芯片組裝成 “ 納米機(jī)器人 ” ，攜帶 DNA 去更換或修復(fù)有缺陷的基因片段 ， 這種技術(shù)仍處于研制初期，但將來(lái) 則 有可能完成在人體細(xì)胞內(nèi)發(fā)放藥物等醫(yī)療任務(wù) [68]。目前用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要輔助元件為金粒、脂質(zhì)體、高分子復(fù)合材料等物理、生物及化學(xué)的納米材料，這些輔助元件都已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)導(dǎo)了目的基因。那時(shí)，人們將能夠借助納米技術(shù)的幫助，按照自己的意愿對(duì)基因進(jìn)行精準(zhǔn)操作。特別是磁性納米 顆粒表現(xiàn)出良好的表面效應(yīng)，比表面激增，官能團(tuán)密度和選擇吸附能力變大，攜帶基因的數(shù)量增加，加之其具有良好的靶向性，這些都將對(duì)提高腫瘤部位外源基因的濃度及轉(zhuǎn)化效率，最終增強(qiáng)治療效果產(chǎn)生重要的作用。根據(jù)某些腫瘤部位的溫度高于正常體溫的特點(diǎn)，制成溫度敏感型靶向脂質(zhì)體，將外源基因特異性地運(yùn)輸至靶細(xì)胞中，基因治療效果明顯提高。因此在納米粒與細(xì)胞相互作用時(shí)，納米粒的正電狀態(tài)也是有利的。其后對(duì)傳統(tǒng)的陰離子型脂質(zhì)體進(jìn)行改進(jìn)，采用人工合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，并在此體系中加入不帶電荷的中性輔助脂，使得轉(zhuǎn)導(dǎo)效率大幅度提高。對(duì)于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的之一的基因治療來(lái)說(shuō)， 納米粒的粒徑也是決定其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和作用時(shí)間的重要因素之一，目前認(rèn)為在構(gòu)建體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)納米微粒時(shí)較好的粒徑尺寸為 200 nm。 表 131 不同粒徑的 1 克納米材料（密度為 1 克 /cm3）的總面積 顆粒直徑（ nm） 顆粒體積（ nm3） 單個(gè)顆粒表面積（ nm2） 總面積（ nm2） 3 1021 1021 6 1020 3 1020 3 1019 超微顆粒的表 面與大 尺寸 物體的表面是十分不同的，若用高倍率電子顯微鏡對(duì)金超微顆粒（直徑為 2x103 微米）進(jìn)行電視攝像，實(shí)時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)這些顆粒沒(méi)有固定的形態(tài)，隨著時(shí)間的變化會(huì)自動(dòng)形成各種形狀（如立方體 、 八面體 、 十面體 、 二十面體多晶等），它既不同于一般固體，又不同于液體，是一種準(zhǔn)固體。按照前述的納米載體輸送基因的三種機(jī)制，不同的納米基因載體對(duì)受體細(xì)胞的選擇性是必然的，尤其是前兩種機(jī)制。圖 138 及圖 139 分別為幾種常見(jiàn)的植物及動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖。 動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，在 基因 轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中少了一道屏障，最適于用納米基因載體實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染。因此在微生物基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，要實(shí)現(xiàn)外源基因的成功轉(zhuǎn)導(dǎo)，首先必須消除細(xì)胞壁和 /或核膜的阻礙，根據(jù)受體細(xì)胞的類型選擇合適的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，如采用合適的酶除去細(xì)胞壁獲得適于轉(zhuǎn)導(dǎo)的原生質(zhì)體，或者采用基因槍技術(shù)等物理轉(zhuǎn)導(dǎo)方法或者電擊法等生物物理方法完成對(duì)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo) 與細(xì)胞種類和細(xì)胞性能的關(guān)系 受體細(xì)胞的類別和性能是影響納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的重要因素。因此，除了前述的兩種機(jī)制之外，我們認(rèn)為納米粒穿透細(xì)胞膜、直接進(jìn)入細(xì)胞可能是一種重要方式，這種方式可能在納米藥物載體和在納米基因載體中都起重要作用。如連接到納米粒上的轉(zhuǎn)鐵蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)納米粒被細(xì)胞吞噬 [44， 45， 75]； 低密度脂蛋白連接于納 米粒也可介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)納米粒的攝入 [52]；半乳糖基連接于納米粒上介導(dǎo)納米粒進(jìn)入細(xì)胞也是由受體介導(dǎo)的 [76]；乳糖酸連接上藥物納米運(yùn)載系統(tǒng)后具有對(duì)肝癌細(xì)胞系的靶向性也說(shuō)明在此系統(tǒng)中納米粒進(jìn)入細(xì)胞機(jī)制是受體介導(dǎo)機(jī)制 [77]，當(dāng)把葉酸連接于高分子納米粒時(shí)，用等離子體共振技術(shù)觀察到了納米粒與葉酸結(jié)合蛋白的結(jié)合，而未連接葉酸的高分子納米粒則不與葉酸結(jié)合蛋白結(jié)合 [78]，這一結(jié)論也支持受體介導(dǎo)納米粒 進(jìn)入細(xì)胞的機(jī) 制。這個(gè) DNA 片段是人類基因組測(cè)序研究中發(fā)現(xiàn)的最長(zhǎng)的 DNA 片段。也有不同的研究小組指出，人類基因數(shù)目約有 6 萬(wàn)個(gè)基因。由于其研究對(duì)象為人類自身，因此最為引人注目。這 4 種堿基通過(guò)嚴(yán)格配對(duì)后構(gòu)成了 DNA 分子中的兩種不同的堿基對(duì)，即 A 對(duì) T， C 對(duì) G。 圖 134 紅細(xì)胞顯微圖片 390 圖 135 光學(xué)顯微鏡下的人類染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)圖 圖 136 染色體與 DNA[68] 最早揭示 DNA 結(jié)構(gòu)特征的是著名物理學(xué)家 Watson 和 Crick。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的直接對(duì)象 — 細(xì)胞是微米級(jí)生物材料，一般細(xì)胞直徑在 10μ m~100μ m 左右；人的卵細(xì)胞直徑約 120μ m~200μ m 左右，有些動(dòng)物的卵細(xì)胞 尺寸要大得多，如鴕鳥(niǎo)的卵細(xì)胞的直徑將近 10 cm。 在人類疾病的預(yù)防方面，納米技術(shù)也有非常重要的應(yīng)用，例如， 納米粒比紅細(xì)胞還小許多，可以在血液中自由運(yùn)行， 因此 在疾病的診斷和治療中發(fā)揮 著 獨(dú)特 的 作用 [71,72]。作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的直接受體，細(xì)胞雖然是微米級(jí)材料，但其在細(xì)胞內(nèi)的直接對(duì)象是染色體DNA 或質(zhì)體 DNA 以及對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)有直接作用的組成細(xì)胞的物質(zhì) 核酸、蛋白質(zhì)、脂類和其它復(fù)雜的生物分子。 Boot 等 [67]利 用感染性囊狀病病毒 (infectious bursal disease virus ， IBDV)的 RNA 和 cDNA 與堿性磷酸酶報(bào)告基因連接后進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用 cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)堿性磷酸酶報(bào)告基因蛋白及 IBDV 蛋白的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于用 RNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)的表達(dá)量，說(shuō)明利用cDNA 轉(zhuǎn)導(dǎo) 的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于利用 RNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。 把 PKC 的反義寡核苷酸吸附于用溴化十