【正文】 389 糖 [45]等；人工合成高分子納米載體主要有聚氰基丙烯酸烷基酯 [63]類（如聚氰基丙烯酸己基酯 [62]、聚氰基丙烯酸異丁基酯 [61]）、聚甲基丙烯酰胺類 [49]、聚乳酸 [47， 60]、聚乙烯二醇 [51]、葡聚糖 [62]、聚賴氨酸 [51，52]等；無(wú)機(jī)納米載體主要有金、硅 [49， 50]、磷酸鈣等。 3．基因的結(jié)構(gòu)與特征 隨著現(xiàn)代生物學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，人類在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究?jī)?nèi)容早已從具有微米尺寸的細(xì)胞深入到更小的層次如納米量級(jí)，進(jìn)入到單個(gè)分子甚至分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。研究這些具有納米尺度范圍的分子結(jié)構(gòu)以及由此產(chǎn)生的生命現(xiàn)象的學(xué)科，即納米生物學(xué)和納米醫(yī)學(xué)。在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)中的外源基因的直接受體則是染色體（ DNA 序列）或質(zhì)體 DNA。 圖 134 所示為人類紅細(xì)胞的微米級(jí)長(zhǎng)度特性；而圖 135 及圖 136 所示分別為人類染色體結(jié)構(gòu)圖及 染色體與 DNA 比較模式圖 。雖然染色體及染色體片段的特征尺寸為微米級(jí)或亞微米級(jí)，但決定其生物學(xué)功能的真正單位 — 基因及由基因組成的 DNA 片段的特征尺寸都在納米范圍內(nèi)。 因此，納米生物學(xué)和納米醫(yī)學(xué)中的研究對(duì)象與以往的微米尺度研究對(duì)象比較要微小得多。 1953 年，他們首次發(fā)現(xiàn)了 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)，并揭示了 DNA 半保留復(fù)制的機(jī)制。經(jīng) X 射線衍射研究表明，兩條 DNA 鏈的分子直徑為 2 .4 nm，雙螺旋的螺 距為 nm。 。 DNA 分子含有 4 種堿基，分別為 A（腺嘌呤堿基， adenine）， T（胸嘧碇堿基， thymine）， C（胞嘧碇堿基， cytosine）和 G（鳥(niǎo)嘌呤堿基， guanine）。 DNA 分子在復(fù)制時(shí)，先斷開(kāi) AT 和 CG 堿基對(duì)間的氫鍵，使兩條磷酸核糖主鏈解開(kāi)。因此，在兩條新復(fù)制的 DNA 分子中都含有一條 391 復(fù)制前的磷酸核糖主鏈（稱為父輩主鏈），其遺傳密碼與復(fù)制前的 DNA 分子完全相同，這就是為什么DNA 分子可以通過(guò)復(fù)制把遺傳信息準(zhǔn)確無(wú)誤地一代傳給另一代。 目前我們已經(jīng)進(jìn)入到基因組時(shí)代。對(duì)人類基因組進(jìn)行測(cè)序的計(jì)劃被稱為人類基因組計(jì)劃（ Human Genome Project， HGP）也被稱為“生命科學(xué)阿波羅登月計(jì)劃”。人類基因組計(jì)劃與曼哈頓原子彈計(jì)劃、阿波羅登月計(jì)劃并稱為 20 世紀(jì)人類三大科技工程。中國(guó)也于 1994 年參加了該計(jì)劃的研究工作，承擔(dān)并順利地完成了 1%的測(cè)序工作。標(biāo)志著這一天成為了人類歷史上“值得載入史冊(cè)的一天”。根據(jù) 2022 年 2 月 12 日的報(bào)道，在對(duì)基因圖譜進(jìn)行初步分析研究后推算，人類的基因數(shù)目只有約 ~ 萬(wàn)個(gè)。雖然兩者之間存在較大差別，現(xiàn)在的結(jié)果表明人類基因數(shù)目比最初預(yù)言的10 萬(wàn)個(gè)要少得多。 染色體中承載基因的 DNA 雙螺旋的螺距為 nm，一個(gè)螺距內(nèi)共含有 10 個(gè)堿基對(duì)。 1999 年 12 月 1 日，人類基因組全部破譯了人體的第 22 號(hào)染色體。如果按一個(gè)螺距（ nm）中含有 10 個(gè)堿基對(duì)來(lái)計(jì)算，這個(gè)最長(zhǎng)的 DNA 竟長(zhǎng)達(dá) m，當(dāng)然它是纏繞在染色體的內(nèi)部，而且絕大部分堿基對(duì)并不包含任何遺傳信息。第 22 號(hào)染色體的基因長(zhǎng)度也是長(zhǎng)短不等的，范圍從 1 000 個(gè)堿基對(duì)（約長(zhǎng) μ m）到 萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)（約長(zhǎng) 198 μ m），而平均長(zhǎng)度為 19 萬(wàn)堿基對(duì)（約長(zhǎng) 64 μ m）：研究還發(fā)現(xiàn)，第 22 號(hào)染色體的基因主要與人的先天性心臟病，免疫功能低下，精神分裂癥，智力低下和許多惡性腫 瘤如白血病等有關(guān)；而只有 225 個(gè)基因的人體內(nèi)最小的第 21 號(hào)染色體，則主要與人的白血病，先天性癡呆，早老性癡呆，肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥，以及狂躁性抑郁癥和部分癌癥等有關(guān)。 核酸分子是線狀親水性分子，難以通過(guò)細(xì)胞膜屏障進(jìn)入細(xì)胞及細(xì)胞核，細(xì)胞膜上也不存在核酸通道，因此單純的核酸分子無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞更難實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的目標(biāo)。也有人直接把 DNA 同一些帶正電荷的物質(zhì)共沉積，制備出帶正電荷的納米 DNA，從而實(shí)現(xiàn) DNA 進(jìn)入細(xì)胞。 納米粒進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制按目前研究報(bào)道可以分為兩類：一類是納米粒上連接有特殊配基，通過(guò)受體介導(dǎo) 機(jī)制幫助實(shí)現(xiàn)納米粒進(jìn)入細(xì)胞。另一類報(bào)道則特指吞噬細(xì)胞對(duì)納米粒的攝入是通過(guò)吞噬作用實(shí)現(xiàn)的。許多報(bào)道指出，進(jìn)入體內(nèi)的納米粒主要富集于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)。顯然這一機(jī)制只能解釋具有吞噬功能的細(xì)胞對(duì)納米粒的攝入。然而許多細(xì)胞在一般情況下不具有吞噬功能，同時(shí)納米粒上 也未連接特殊配基，從而排除了通過(guò)受體介導(dǎo)途徑為細(xì)胞所吸收的可能，此時(shí)細(xì)胞對(duì)納米粒的吸收顯然應(yīng)具有另一種途徑。對(duì)此我們分別選用兩種無(wú)機(jī)納米粒，用透射電鏡觀察同一種細(xì)胞對(duì)它們的攝入情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第一種納米粒在細(xì)胞內(nèi)有膜包裹，而第二種納米粒子在細(xì)胞內(nèi)無(wú)膜包裹，由此可以初步認(rèn)為第一種納米粒子主要通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，第二種納米粒主要通過(guò)穿膜途徑進(jìn)入細(xì)胞。 393 因此可以認(rèn)為具有適當(dāng)表面特性的納米粒可以通過(guò)穿膜途徑進(jìn)入細(xì)胞。 無(wú)論攜帶外源基因的納米粒通過(guò)細(xì)胞的受體介導(dǎo)機(jī)制、細(xì)胞吞噬機(jī)制或直接穿膜作用機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞，其攜帶 DNA 進(jìn)入細(xì)胞的能力都與納米粒 DNA 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及表面狀態(tài)有關(guān)。 綜上所述，納米粒進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制有受體介導(dǎo)、細(xì)胞吞噬和納米載體直接穿膜三種方式。根據(jù)生物類別，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體細(xì)胞即指來(lái)源于微生物、植物和動(dòng)物的細(xì)胞。 微生物又可分為原核微生物和真核微生物兩類。作為質(zhì)?；蚴删w的受體，這類工程菌在分子生物學(xué)的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究中有著十分廣泛的應(yīng) 用。而對(duì)于以真核微生物細(xì)胞如酵母細(xì)胞為受體的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，除了細(xì)胞壁的屏障之外，還存在核膜的阻礙作用。 植物細(xì)胞受體體系分為低等植物轉(zhuǎn)導(dǎo)體系如藻類和高等植物轉(zhuǎn)導(dǎo)體系如小麥等 。同時(shí)植物的不同組織的細(xì)胞，由于其分化程度的差異，組織培養(yǎng)及其植株再生能力差別很大。禾谷類作物總體來(lái)說(shuō)離體培養(yǎng)較困難，且各種作物之間的差別極大。因此，在植物基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中 ，合適的受體材料的選擇及高頻再生系統(tǒng)的建立是基因轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得成功的重要保證。但在選擇載體及導(dǎo)入方法時(shí)，必須區(qū)別對(duì)待且有所選擇。因此在動(dòng)物轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，首先必須考慮它的功能部位，有些基因只在特定的組織器 394 官中表達(dá)并行使其功能，因此必須將基因準(zhǔn)確送達(dá)該種組織或器官?？蓪⒛康幕蛩腿肱咛ゼ?xì)胞，隨著個(gè)體的發(fā)育，目的基因會(huì)按一定的時(shí)空順序來(lái)表達(dá)。但細(xì)胞核亦有核膜包圍，難度更大，因而要根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)材料與受體細(xì)胞選擇合適的轉(zhuǎn)導(dǎo)方案。 同為動(dòng)物細(xì)胞，不同的細(xì)胞種類的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的條件也會(huì)有很大不同。 圖 137 典型細(xì)胞 (示細(xì)胞的微米大小 ) (a) (b) 圖 138 植物細(xì)胞圖 a, 示植物細(xì)胞壁 。 b, 肌肉細(xì)胞 。 d, 神經(jīng)細(xì)胞 即使在體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，也與細(xì)胞種類有很大關(guān)系。對(duì)于受體介導(dǎo)機(jī)制而言，帶有特定配基的納米載體只能將基因轉(zhuǎn)入有相應(yīng)受體的細(xì)胞內(nèi)；對(duì)于吞噬機(jī)制而言，納米載體只能將基因輸送到具有吞噬功能的細(xì)胞中。細(xì)胞膜的流動(dòng)性、細(xì)胞的活力、細(xì)胞所處的周期時(shí)相等都將影響納米粒子的穿膜作用。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與納米粒尺寸的關(guān)系 納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的應(yīng)用與納米粒的尺寸有很大的關(guān)系。隨著顆粒直徑變小，比表面積會(huì)顯著增大，單位質(zhì)量的納米材料的總表面積 以及材料所能吸附的質(zhì)粒數(shù)量也隨之顯著增加，結(jié)果見(jiàn)表 131。在電子顯微鏡的電子束照射下，表面原子仿佛進(jìn)入了 “ 沸騰 ” 狀態(tài)，尺寸大于 10 納米后才看不到這種顆粒結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，這時(shí)微顆粒具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。一般認(rèn)為，納米?？梢愿淖兡み\(yùn)轉(zhuǎn) 機(jī)制，增加生物膜的 通透性 ，有利于 外源基因突破細(xì)胞膜的障礙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)中，脂質(zhì)體的大小對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也會(huì)產(chǎn)生十分重要的影響。相反，如果使用大尺寸的脂質(zhì)體，往往會(huì)造成在脂質(zhì)體與 DNA 形成復(fù)合物后脂質(zhì)體發(fā)生聚集，甚至出現(xiàn)沉淀，最終導(dǎo)致外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)失 敗。 按照前述的納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)三種機(jī)制，受體介導(dǎo)機(jī)制和穿膜機(jī)制必然要求較小的粒徑，尤其是穿膜機(jī)制，顯然，納米粒徑越小越容易實(shí)現(xiàn)穿膜。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo) 與納米粒表面電荷的關(guān)系 納米粒的表面電荷影響到納米粒與細(xì)胞膜的相互作用，同時(shí)也會(huì)影響其承載外源 DNA 或 RNA的能力。另外，負(fù)電荷表面往往使納米粒相對(duì)于正電荷或中性表面在體內(nèi)更易被清除，而中性的表面最適合用于延長(zhǎng)納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。其明顯的缺點(diǎn)就是包封率低，而且容易被溶酶體溶解破壞。利用納米級(jí)高分子聚合物作為載體的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究也表明采用陽(yáng)離子共聚復(fù)合物較為合適，但其中加入非離子型聚合物則可以加強(qiáng)載體對(duì)外源 DNA 的保護(hù)。納米粒電荷改性一般采用 納米粒包衣 的方式進(jìn)行，如 分別用血漿蛋白和血清補(bǔ)體對(duì)聚甲基丙烯酸甲酯（ PMMA）納米粒包衣，研究包衣前后 RES 對(duì)納米粒的攝取情況 等 。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用卵磷脂做膜模型時(shí)，同一種納米粒，其表面電荷向正方向改變更有利于納米粒進(jìn)入膜囊泡，而且對(duì)于所研究的三種納 米粒均有相同結(jié)論。據(jù)報(bào)道，帶正電荷的硅納米粒由于負(fù)載較多 DNA 而使納米粒與外源 DNA 的復(fù)合體帶電狀態(tài)成為負(fù)電性，此時(shí)該復(fù)合體雖然仍能轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞，但其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低于當(dāng)復(fù)合體帶狀態(tài)為正電性時(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 [49]。同時(shí)，我們也注意到，作為藥物載體的納米顆粒一般不帶電荷或帶有負(fù)電荷，許多這樣的納米粒也能夠進(jìn)入細(xì)胞，因此，納米粒進(jìn)入細(xì) 胞時(shí)其表面荷電狀態(tài)與其被細(xì)胞的吸收能力之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。采用基因槍法進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，如何進(jìn)一步提高納米載體的密度，增加其穿透細(xì)胞壁時(shí)所具有的動(dòng)量就是一個(gè)十分重要的問(wèn)題。一般來(lái)說(shuō)，疏松多孔的納米結(jié)構(gòu)能夠結(jié)合或吸附更多的外源基因，同時(shí)由于其空間效應(yīng)的存在，也能使其成為外 源基因抵抗核酸酶分解的天然屏障。研究表明通過(guò)改變現(xiàn)有脂質(zhì)體組成，將其制成 pH 敏感型脂質(zhì)體，其轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠 LtK細(xì)胞的效率提高 8 倍。通過(guò)改變載體的親水或疏水特性，改變其與外源DNA 分子結(jié)合能力及結(jié)合狀態(tài)，也將對(duì)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率產(chǎn)生影響。 目前用于惡性腫瘤進(jìn)行基因治療的載體主要由金屬納米粒、無(wú)機(jī)非金屬納米粒、生物降解性高分子納米粒和生物性顆粒構(gòu)成。膠體金于 40 年前用于細(xì)胞器官染色，以便在電鏡下對(duì)細(xì)胞分子進(jìn)行觀察與分析。 在非金屬無(wú)機(jī)材料中，磁性納米材料最為引人注目，已成為目前新興生物材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 除上述一些因素影響外，外源基因的種類、受體材料的特性、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法等均會(huì)對(duì)納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生一定的影響。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可能與納米載體的形狀有關(guān)，比如針狀的納米?？赡芫哂懈叩霓D(zhuǎn)導(dǎo)效率。 展望 雖然納米基因轉(zhuǎn)導(dǎo)已經(jīng)取得了一定的成功，如已經(jīng)成功的應(yīng)用納米材料實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因在受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化、整合及表達(dá)，但是目前對(duì)基因和質(zhì)粒的操作主要還是通過(guò)限制性內(nèi)切酶的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。隨著納米科學(xué)的進(jìn)步、納米學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展，直接對(duì)單個(gè)原子、分子及其組成部分進(jìn)行操作將成為一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的技術(shù)而得到廣泛的應(yīng)用。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是以質(zhì)粒的形式進(jìn)行，因此如何能夠快速、高效地構(gòu)建及復(fù)制出大量的質(zhì)粒就成為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程能否順利進(jìn)行的最主要的制約因素之一。而應(yīng)用細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒雖然能夠?qū)崿F(xiàn)質(zhì)粒擴(kuò)增的目的，但由于通過(guò)細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒本身就是一個(gè)間接的過(guò)程，同時(shí)又必須考慮因細(xì)菌基因及其產(chǎn)物影響所擴(kuò)增的質(zhì)粒而導(dǎo)致的對(duì)此后的遺傳轉(zhuǎn)化造成的潛在負(fù)面影響，因此如果能夠應(yīng)用納米技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行精確可控的構(gòu)建，并在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)其直接、快速的大量擴(kuò)增，將為高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)提供充足的、高質(zhì)量的目的基因來(lái)源。目前質(zhì)粒的存在形式有線狀、環(huán)狀、超螺旋狀及介于以上三種類型之間的形式，今后則可以通 過(guò)納米技術(shù)進(jìn)一步減小質(zhì)粒的體積，增加其密度。 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的輔助元件是整個(gè)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。但目前使用的這些輔助元件還存在著轉(zhuǎn)化效率低、價(jià)格昂貴、制備困難等缺點(diǎn)。另外可以通過(guò)納米技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)載體的改造，增強(qiáng)載體對(duì)外源 DNA 的屏蔽作用，以降低核酸酶對(duì)外源 DNA 的降解，并能使外源基因在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用。但是它和其他技術(shù)一樣，也被基因安全問(wèn)題所困擾，基因安全問(wèn)題包括了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全問(wèn)題（轉(zhuǎn)基因食品安全，轉(zhuǎn)基因藥物安全），以及基因環(huán)境安全問(wèn)題等。這些方面的問(wèn)題都正在由人們用改進(jìn)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)解決。 400 參考文獻(xiàn) 1 Massiah A, Rong H L, Brown S, et al. 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