【正文】 的大小約為 200 kb，故目前通常采用易于操作的小質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建載體。構(gòu)建的方法是將用于轉(zhuǎn)化的基因克隆到大腸桿菌質(zhì)粒上的左、右邊界序列之間，然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到一個(gè)已經(jīng)從 Ti 質(zhì)粒上去掉了 TDNA 內(nèi)部序列的非致瘤農(nóng)桿菌菌株中。在早期的研究中，克隆的基因是通過(guò)同源重組整合到 Ti 質(zhì)粒上，然后用這種農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種系統(tǒng)要求在 TDNA 內(nèi)攜帶細(xì)菌篩選標(biāo)記基因以便篩選重組子，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不是很高。后來(lái)發(fā)現(xiàn) Vir 基因的反式作用（即 Vir 基因在實(shí)現(xiàn) TDNA 轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，不一定要與 TDNA 在同一質(zhì)粒 DNA 上），借此發(fā)現(xiàn)隨后開(kāi)發(fā)出了雙元載體系統(tǒng)。人們把 380 不含 TDNA 的非致瘤 Ti 質(zhì)粒分離出來(lái)，構(gòu)建廣譜宿主范圍的質(zhì)粒，即在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中都能復(fù)制的質(zhì)粒。質(zhì)粒上帶有 TDNA 的左、右邊界序列，它們之間有多克隆位點(diǎn)。這樣，目的基因就能很容易地構(gòu)建到這個(gè)雙元載體上，轉(zhuǎn)入并保持在農(nóng)桿菌中，然后轉(zhuǎn)入植物中。這一改進(jìn)使外源目的基因?qū)朕r(nóng)桿菌載體系統(tǒng)以及構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的工作變得易于進(jìn)行。自從 1983 年人們利用根瘤農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens) 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得第一株轉(zhuǎn)基因植株以 來(lái)，這一技術(shù)已獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，并被廣泛應(yīng)用到大部分雙子葉和一部分單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，該系統(tǒng)為人類(lèi)利用生物技術(shù)改造自然界開(kāi)辟了廣闊的前景。隨著人們對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化機(jī)理的深入了解及對(duì)轉(zhuǎn)化方法的不斷改進(jìn)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)法也已在 水稻 [31]、玉米 [32]、小麥 [33]、大麥 [34]等重要的單子葉作物中獲得成功。與基因槍法等直接轉(zhuǎn)化法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化有以下優(yōu)點(diǎn) [35]： ① 該轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是天然的遺傳工程系統(tǒng)，其轉(zhuǎn)化成功率高，效果顯著； ② 操作簡(jiǎn)便，不需要特 殊的儀器設(shè)備； ③ 可轉(zhuǎn)導(dǎo)特定的 DNA 片斷，且允許插入可達(dá) 50 kb 的較大 DNA 片斷； ④ 整合的拷貝數(shù)一般較少，通常為一到幾個(gè)拷貝，從而減少甚至避免因整合拷貝數(shù)高而發(fā)生的基因沉默現(xiàn)象； ⑤ 無(wú)需進(jìn)行耗時(shí)費(fèi)力且困難的原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)； ⑥ 轉(zhuǎn)化頻率較高，可高達(dá) 30%[36]，而微彈轟擊法或原生質(zhì)體融合法則只能達(dá)到 2%左右。 2．脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法 脂質(zhì)體是 1965 年由 Bangham 首次發(fā)現(xiàn)的。它是一 種人工制備的類(lèi)脂質(zhì)的小球體，由一個(gè)或多個(gè)類(lèi)似于細(xì)胞膜的類(lèi)脂雙分子層包裹著水相介質(zhì)組成。構(gòu)成雙分子層的類(lèi)脂其親水性的頭部形成膜的內(nèi)外表面，而親脂性的尾部處于膜的中間，膜壁的厚度約為 5nm~7nm，而囊的直徑一般在 25nm~500nm之間 , 故稱之為脂質(zhì)納米粒。如圖 132 所示，脂質(zhì)體的這種結(jié)構(gòu)使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩親的外源物質(zhì)。這些物質(zhì)或被包入脂質(zhì)體內(nèi)部水相，或插入類(lèi)脂雙分子層，或吸附連接在脂質(zhì)體的表面。由于脂質(zhì)體是由可生物降解的磷脂組成的雙分子層結(jié)構(gòu)，所以與生物膜有較大的相似性和組織相容性。自 Banghan 等發(fā)明并作為生物膜模型研究以來(lái)，至今已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。關(guān)于脂質(zhì)體的論述詳見(jiàn)本書(shū)第六章， 20 世紀(jì) 70 年代后期， Robert 等將細(xì)菌質(zhì)粒 DNA 包入脂質(zhì)體，由此開(kāi)始了脂質(zhì)體在分子生物學(xué)領(lǐng)域的新應(yīng)用。而 20 世紀(jì) 80 年代中期出現(xiàn)的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，則將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率提高了 10 多倍。與其它方法相比，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)的優(yōu)點(diǎn)在于經(jīng)脂質(zhì)體包裹的外源基因具有高效、無(wú)潛在感染及能使目標(biāo)基因定向轉(zhuǎn)移到特定組織的優(yōu)勢(shì)。 381 圖 132 脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)模式圖 [37] 脂質(zhì)體是由磷脂雙分子構(gòu)成的雙分子層囊泡。最初用作基因載體的脂質(zhì)體是由天然磷脂如卵磷脂、腦磷脂及膽固醇所構(gòu)成的中性或帶陰離子電荷的陰離子脂質(zhì)體，使用時(shí)將質(zhì)粒 DNA 包入脂質(zhì)體內(nèi)部，但包封率較低，因而容易被溶酶體溶解破壞。 1987 年 Felgner 等合成了陽(yáng)離子脂質(zhì)體 N[1(二油?；?)丙基 ]N,N,N三乙胺氯 (DOTMA)，其分子結(jié)構(gòu)有一帶季銨陽(yáng)離子的頭部和兩個(gè)長(zhǎng)鏈的不飽和脂肪酸的尾部（主體）。由 DOTMA 構(gòu)成的脂質(zhì)體可與 DNA 自發(fā)形成復(fù)合物，其結(jié)合率可達(dá) 100%。Felgner 用 DOTMA/DOPE (1:1)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo) pSV2CAT 到各種細(xì)胞中如 COS7 細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞等，結(jié)果表明這種陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是 DEAEDextran 和磷酸鈣鹽沉淀法的 5~10 倍。 目前已合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體不少于 20 余種，其基本結(jié)構(gòu)都由兩部分組成。疏水性的脂肪酸鏈或膽固醇基構(gòu)成的尾部和親水性的帶正電荷的頭部。后者是陽(yáng)離子脂質(zhì)體的功能部位，它們與 DNA 的磷酸基結(jié)合或與細(xì)胞膜脂帶負(fù)電荷的部分結(jié)合。陽(yáng)離子脂質(zhì)體的另一個(gè)組分為不帶電荷的中性脂分子，也叫輔助脂，它們對(duì)提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有重要作用。 DOPE 是一種最 重要的輔助脂。 Farhood 研究了DOPE 在陽(yáng)離子脂質(zhì)體 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的作用。他們?cè)?DNA 脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的同時(shí)，加入由DOPE/DCChol 組成的空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入一定量的空白脂質(zhì)體后，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最大可增加 8 倍。 中性脂質(zhì)體和陰離子脂質(zhì)體與 DNA 作用較為簡(jiǎn)單，主要是質(zhì)粒 DNA 被脂質(zhì)體包裹，而陽(yáng)離子脂質(zhì)體與 DNA 的作用則較為復(fù)雜，因此是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前認(rèn)為陽(yáng)離子脂質(zhì)體與 DNA 有如下幾種作用形式： ① DNA 靠靜電吸引力結(jié)合在陽(yáng)離子脂質(zhì)體的外表面； ② 帶負(fù)電的 DNA 完全進(jìn)入脂質(zhì)體內(nèi)部； ③ 線型 DNA 的周?chē)鼑p層結(jié)構(gòu)， DNA 與脂質(zhì)分子之間靠靜電吸引而相互作用，但此時(shí)的脂質(zhì)體已不具備完整性，脂分子呈線性排列在 DNA 的周?chē)Ｖ|(zhì)體與 DNA 的作用受其組成、大小、所帶電荷、環(huán)境 pH 值、脂質(zhì)體與 DNA 的比例等因素的影響。其中脂質(zhì)體與 DNA 的比例 382 對(duì)于轉(zhuǎn)導(dǎo)效率至關(guān)重要，而且受體細(xì)胞的種類(lèi)不同，兩者的比例也隨之改變。如 DOTMA/DOPE (1:1)，脂質(zhì)體與質(zhì)粒 pSV2CAT 之比 10:1 時(shí)，其轉(zhuǎn)導(dǎo) COS7 細(xì) 胞的效率最高，而 DCChol/DOPE (3:2)與pUCSV2CAT 的比為 6:1 時(shí)，其遺傳轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高。 脂質(zhì)體介導(dǎo) DNA 進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制目前尚不十分清楚。 Felgner 認(rèn)為脂質(zhì)體是通過(guò)膜融合將 DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞的。 Pinnadunege 則認(rèn)為最可能的機(jī)制是通過(guò)細(xì)胞的吞噬作用，即脂質(zhì)體和 DNA 的復(fù)合物被吞噬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和溶酶體，然后陽(yáng)離子脂質(zhì)體在該處破裂而將 DNA 釋放使之進(jìn)入細(xì)胞漿。 生物物理方法 1．電擊法 電擊法利用高壓電脈沖使細(xì)胞膜發(fā)生瞬間的可逆穿孔，從而使游離的外源基因穿過(guò)細(xì)胞膜而轉(zhuǎn)移 到細(xì)胞中去。許多真核與原核生物由于沒(méi)有合適的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，無(wú)法進(jìn)行有效的遺傳操作。有的雖然已建立了轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，但轉(zhuǎn)化效率低，且操作繁瑣費(fèi)時(shí)。電擊法則較好地解決了這些問(wèn)題。電擊穿孔（簡(jiǎn)稱電穿孔）操作對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生的副作用小，從而保持活細(xì)胞的正常生理?xiàng)l件。電穿孔的脈沖參數(shù)和過(guò)程容易控制，強(qiáng)度適當(dāng)?shù)碾娒}沖不會(huì)使 DNA 和受體細(xì)胞受到任何損害，因此電擊法是一種很有前途的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。這種方法操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化效率高，沒(méi)有細(xì)胞種屬的限制，細(xì)胞電穿孔技術(shù)對(duì)各種類(lèi)型的細(xì)胞都具有高效率、低毒性、普遍性和可控性的優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用 于細(xì)胞工程和基因工程等方面，成為實(shí)現(xiàn)動(dòng)、植物細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種常用方法。 He 等 [10,40]利用 該方法成功的進(jìn)行了硬粒小麥與大麥雜交種及面包小麥的遺傳轉(zhuǎn)化，得到了外源基因正確表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。 Li 等 [38]成功地利用該方法獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株。李克勤等 [39]則利 用電擊法將人組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 1在 Pichia pastoris 酵母中重組表達(dá)。 電穿孔過(guò)程本身是一種物理過(guò)程而不是生物過(guò)程，在電擊法轉(zhuǎn)化中， DNA 進(jìn)入受體細(xì)胞雖然受外加電壓的影響，但主要是由外源 DNA 與受體細(xì)胞共同完成的，因而是典型的生物物理過(guò) 程。 1990年 Chang 等用快速冰凍蝕刻揭示了細(xì)胞電穿孔的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。結(jié)果顯示電穿孔觸發(fā)細(xì)胞通透性增加的初始過(guò)程發(fā)生在數(shù)毫秒內(nèi)，電擊孔洞的直徑約為 20nm~40nm，接著引發(fā)了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外噴，在 20 毫秒內(nèi)形成了邊界約為 20nm~100nm 的膜孔洞，并在數(shù)秒內(nèi)保持不變。細(xì)胞在緩沖液中懸浮，好像是一種絕緣的由雙面含有水溶液的細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)，施加電場(chǎng)后則會(huì)使細(xì)胞膜上的電荷分離，于是產(chǎn)生了橫跨膜的電位差，異性電荷在細(xì)胞膜上相互吸引，使細(xì)胞膜變薄，在某一臨界電場(chǎng)強(qiáng)度下，引起細(xì)胞膜的破裂和氣孔的形成，使遺傳基因轉(zhuǎn)移到細(xì) 胞中去。如果電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖寬度適當(dāng)?shù)脑挘瑘?chǎng)強(qiáng)移去后，細(xì)胞破裂和形成的孔可以愈合，應(yīng)用電擊法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的過(guò)程見(jiàn)圖 133。細(xì)胞膜的可逆電穿擊現(xiàn)象不同于膜的力學(xué)破裂，其效應(yīng)完全是可逆的。即撤去電場(chǎng)后，細(xì)胞膜將迅速恢復(fù)到原來(lái)的高電阻 383 率和低透過(guò)性狀態(tài)，但是當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度超過(guò)臨界擊穿電壓的 26 倍或膜在電場(chǎng)中的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)導(dǎo)致膜的 不可逆破裂。 圖 133 電擊法基因轉(zhuǎn)移模式圖 [40] 影響電擊法基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的因素很多，如電壓電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖波形、脈沖持續(xù)時(shí)間 、電融合緩沖溶液的滲透壓、細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞緩沖液的介質(zhì)阻抗、 DNA 分子的組成形式 等 [41]。 其中關(guān)鍵是能否給出適量的高壓電沖擊使細(xì)胞膜產(chǎn)生電介質(zhì)可逆瞬時(shí)穿孔，從而為外源基因?qū)爰?xì)胞提供條件。 2．胚胎干細(xì)胞法 胚泡發(fā)育期的胚細(xì)胞是可以人工培養(yǎng)增殖的，當(dāng)把這種胚細(xì)胞重新導(dǎo)入另一胚泡期的胚之后，它仍然保持著分化成其它類(lèi)型細(xì)胞的能力，這種細(xì)胞叫做多功能胚胎干細(xì)胞，簡(jiǎn)稱 ES 細(xì)胞。 ES 細(xì)胞系的建立，首先要分離胚泡的內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)，將胚泡放入培養(yǎng)皿中分離內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)，再用胰蛋白酶處理分散細(xì)胞，然后放入飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)。 ES 細(xì)胞在 無(wú)飼養(yǎng)層的平板中培養(yǎng)會(huì)持續(xù)分化成肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種專(zhuān)門(mén)功能的細(xì)胞，只有在含有成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層或含有白血病抑制因子的飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)時(shí)才能保持其未分化狀態(tài)并保持 ES 細(xì)胞的潛在分化能力。在對(duì) ES 細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中，人們可以對(duì)它進(jìn)行基因工程操作，而不改變它的分化能力，研究人員通常利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體、電擊法等多種方法將外源基因?qū)?ES 細(xì)胞。這樣，將基因轉(zhuǎn)入并整合到 ES 細(xì)胞基因組內(nèi)的某一非必要基因位點(diǎn)上，然后對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行篩選培養(yǎng)，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這種方法避免了在 DNA 微注射法與反轉(zhuǎn)錄病毒載體方法中存在的基因隨機(jī) 整合的問(wèn)題。 用于 ES 細(xì)胞的 DNA 載體一般帶有定點(diǎn)整合元件。這個(gè)整合位點(diǎn)應(yīng)該選定在基因組內(nèi)編碼非必需產(chǎn)物的地方，以減少整合的 DNA 對(duì)細(xì)胞正常發(fā)育及功能的干擾。轉(zhuǎn)入基因必需要整合在基因組中可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。同時(shí)， DNA 載體轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)的 ES 細(xì)胞中，有的是 DNA 分子整合到了錯(cuò)誤的位點(diǎn)上，有的是整合到正確的位點(diǎn)上，還有大量 ES 細(xì)胞根本就未發(fā)生整合。通常采用一種叫正 負(fù)選擇 384 的策略來(lái)富集整合正確的 ES 細(xì)胞，即首先用正選擇的方法挑選所用整合 DNA 的 ES 細(xì)胞，再用負(fù)選擇方法淘汰整合錯(cuò)誤的細(xì)胞。 正確整合的轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞系 經(jīng)培養(yǎng)后就可以移入胚泡期的胚胎。將這些胚胎移植到假孕的母鼠子宮內(nèi)，這樣產(chǎn)生的部分子代的生殖細(xì)胞就是由轉(zhuǎn)基因的 ES 細(xì)胞形成的。然后在得到的轉(zhuǎn)基因鼠間進(jìn)行雜交，子代再配對(duì)雜交。這樣，將有 1/4 的得到整合的轉(zhuǎn)基因鼠，即轉(zhuǎn)入基因可以和正常基因一樣分離。 納米技術(shù)在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)中的應(yīng)用 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中涉及到的轉(zhuǎn)化元件及輔助元件均為天然的納米材料，本節(jié)將概述納米技術(shù)在DNA 和 RNA 等轉(zhuǎn)導(dǎo)中的應(yīng)用。 在 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)中的應(yīng)用 在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中外源基因及其構(gòu)建體多為納米尺度的 DNA 分子，因此這種轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)際上 大多涉及到納米技術(shù)。在前述的各種轉(zhuǎn)導(dǎo)方法中，除了顯微注射、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆轉(zhuǎn)錄病毒法外，其它各種轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)都是利用納米級(jí)載體攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，因此屬于典型的納米操作范疇。基因槍法的實(shí)質(zhì)是納米或微米級(jí)的子彈荷載 DNA 分子，以高速穿透細(xì)胞膜，從而將 DNA 分子運(yùn)載進(jìn)入細(xì)胞染色體 DNA 中。聚乙二醇法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法都相當(dāng)于應(yīng)用一種可以進(jìn)入細(xì)胞的納米級(jí) DNA載體介導(dǎo)外源 DNA的轉(zhuǎn)化。電擊法則是應(yīng)用納米技術(shù)在受體細(xì)胞膜上形成納米級(jí)孔洞，使之成為 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的通道。 隨著對(duì) DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究的不斷深入，用于 外源 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)的新系統(tǒng)包括納米級(jí)基因轉(zhuǎn)化介導(dǎo)系統(tǒng)不斷出現(xiàn) [42]。到目 前為止，已經(jīng)應(yīng)用天然的或合成的介質(zhì)如聚乙烯醇、聚丙烯酯、多糖衍生物（淀粉、果膠和藻酸鹽）等合成了一批新型的磁性納米粒，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、靶向給藥以及 DNA 的提取 [43]等。在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，特別是在基因治療方面，如何安全、高效地將外源基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞中是一個(gè)較為困難的問(wèn)題。一方面，要盡可能多地將外源基因?qū)氲桨屑?xì)胞中，以提高該區(qū)域的外源基因濃度；另一方面，進(jìn)入受體細(xì)胞的外源基因必須能夠抵抗核酸酶的分解作用，并能在一段較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用。目前研 究較多的轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)多為病毒介導(dǎo)的 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，但是這種系統(tǒng)存在著潛在的安全問(wèn)題。另一種系統(tǒng)是脂質(zhì)體介導(dǎo)的 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，其特點(diǎn)為轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、毒性小、無(wú)潛在感染及能使目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到特定組織等。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，人們將能夠制造具有各種特殊性能的納米粒，因此納米粒必將成為基因負(fù)載的理想選擇