【正文】 為質(zhì)粒通常為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)推算其直徑應為 382nm~573 nm，也是典型的納米顆粒。眾所周知，染色體是 DNA 在細胞特定時期的特殊存在形式，是細胞進行分裂活動的主要標志。它們都是納米級生物材料，關(guān)于 DNA 的鏈距、螺距的納米尺寸的定量敘述參見后面的敘述。 基因轉(zhuǎn)導的直接對象 — 細胞是微米級生物材料，一般細胞直徑在 10μ m~100μ m 左右；人的卵細胞直徑約 120μ m~200μ m 左右，有些動物的卵細胞 尺寸要大得多，如鴕鳥的卵細胞的直徑將近 10 cm。這些極其微細的分子結(jié)構(gòu)的特征尺寸大多在 ~100nm 之間，屬于納米尺度范圍。 幾乎所有的納米基因載體都具有以下共同特征：尺寸足夠小，表面帶正電荷，其原因?qū)?在后續(xù)部分討論。 2．基因轉(zhuǎn)導中的納米材料 基因轉(zhuǎn)導過程中所用的載體材料按成分劃分，主要有天然高分子納米材料、合成高分子納米材料、 兩者的復合納米材料、 無機納米材料等。 在人類疾病的預防方面，納米技術(shù)也有非常重要的應用，例如， 納米粒比紅細胞還小許多，可以在血液中自由運行， 因此 在疾病的診斷和治療中發(fā)揮 著 獨特 的 作用 [71,72]。依據(jù)上述實例，直接利用核糖核酸或脫氧核糖核酸制備出基因轉(zhuǎn)導材料染色體、 DNA，或者定向改造目的基因，使人們能按照自己的意愿構(gòu)建 基因，為基因轉(zhuǎn) 導技術(shù)開辟了廣闊的發(fā)展空間 [68,69]。 1989 年美國科學家首次成功地在 電子顯微鏡下“移動” 原子， 并 用原子 “ 拼寫 ” 出斯坦福大學的英文名字 ； 1993 年 中國科學院北京真空物理實驗室 通過 操縱原子，成功地排列 出“ 中國 ”二字。 細胞膜是由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的生物膜，是外源基因?qū)胧荏w細胞的一道屏障，基因轉(zhuǎn)導技術(shù)如電擊法、 PEG 介導法、 磷酸鈣介導法等， 都是通過改變細胞膜的納米級微孔孔徑，將外源基因?qū)胧荏w細胞，從而達到轉(zhuǎn)導 基因的目的。作為基因轉(zhuǎn)導的直接受體，細胞雖然是微米級材料，但其在細胞內(nèi)的直接對象是染色體DNA 或質(zhì)體 DNA 以及對轉(zhuǎn)導有直接作用的組成細胞的物質(zhì) 核酸、蛋白質(zhì)、脂類和其它復雜的生物分子。這是因為，一方面納米基因轉(zhuǎn)導利用納米級的載體攜帶外源基因，以實現(xiàn)或促進靶細胞對外源基因的吸收，達到基因轉(zhuǎn)導的目的；另一方面基因轉(zhuǎn)導外源 DNA 的過程因其所涉及的材料及操作的結(jié)果均為納米級，所以大多數(shù)的基因轉(zhuǎn)導技術(shù)本身也屬于廣義的納米技術(shù)應用范疇 ?；蜣D(zhuǎn)導的主元件有染色體及其片段、裸露 的基因、以質(zhì)粒形式存在的基因以及通過質(zhì)粒得到的只含有目的基因的 DNA片段；基因轉(zhuǎn)導輔助元件包括促進和實現(xiàn)定向遺傳轉(zhuǎn)導的質(zhì)?；蚧虻妮d體，如金粒、脂質(zhì)體、高分子復合物以及其它已經(jīng)在納米基因轉(zhuǎn)導中應用或具有潛在應用價值的納米粒。 納米技術(shù)應用于基因轉(zhuǎn)導的基礎 納米基因轉(zhuǎn)導的機理、材料及外源基因 388 1．納米技術(shù)與基因轉(zhuǎn)導的關(guān)系 在自然界，存在著物理的、化學的和生物的天然納米材料， 基因轉(zhuǎn)導涉及到的因子即為天然的納米材料。 Boot 等 [67]利 用感染性囊狀病病毒 (infectious bursal disease virus ， IBDV)的 RNA 和 cDNA 與堿性磷酸酶報告基因連接后進行轉(zhuǎn)導，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用 cDNA轉(zhuǎn)導時堿性磷酸酶報告基因蛋白及 IBDV 蛋白的表達量遠遠高于用 RNA 轉(zhuǎn)導時的表達量，說明利用cDNA 轉(zhuǎn)導 的效率遠遠高于利用 RNA 轉(zhuǎn)導的效率。魚精蛋白與寡核苷酸也可形成納米粒子，當兩者以適當比例復合時，核酸酶對寡核苷酸的水解幾乎完全檢測不到 ，這種納米粒在 37℃時可以進入細胞，并定位于胞漿和核中，而在 4℃時未能發(fā)現(xiàn)其進入 細胞 [66]。該寡核苷酸納米粒在體內(nèi)主要分布于 肝中 [64]。在選擇 RNA 轉(zhuǎn)化載體時采用生物降解的高聚物，并通過表面改性等提高其與外源 RNA 的結(jié)合能力，同時通過空間效應及化學效應等提高外源 RNA 抵抗核酸酶分解的能力將是今后進行重點研究的方向之一。 把 PKC 的反義寡核苷酸吸附于用溴化十六烷基三甲基銨處理的 聚氰基丙烯酸異丁基酯納米粒子上，再轉(zhuǎn)染 Hep G2 細胞，有效地抑制了 PKC 的 合成 [63]。進一步將轉(zhuǎn)導后的樹狀細胞與類 NK(natural killerlike)的 T 細胞進行共培養(yǎng)，最終使 T 細胞產(chǎn)生對腫瘤的免疫性。如果在 p12RNA 與磷酸鈣一起形成納米級的復合 物后進行 RNA 轉(zhuǎn)導，不但能夠提高 RNA 轉(zhuǎn)導的效率，而且能夠誘導部分無免疫反應的細胞產(chǎn)生免疫反應。然后將p12RNA 轉(zhuǎn)導入人的淋巴細胞中，以檢驗能否通過 RNA 轉(zhuǎn)導使人淋巴細胞獲得對 p12 的免疫能力。目前這種方法在 RNA 轉(zhuǎn)導方面的研究也已經(jīng)開 始 [59]。近來，發(fā)現(xiàn)樹狀細胞在注入了來自腫瘤細胞的 RNA 后能夠合成腫瘤特異性抗 原 [57]，該發(fā) 現(xiàn)為人類癌癥的免疫治療提供了一條新的 途徑 [58]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)外源 RNA不但能夠被真核細胞所吸收，而且進入細胞的外源 RNA 還能在靶細胞中產(chǎn)生一系列的生物學效應。早在 1971 年就有報道真核生物具有吸收外源 RNA 的能力 [55]，但 是這一發(fā)現(xiàn)在當時并沒有做進一步深入的研究。 把整合素 v 3 連接于 DNA 的陽離子納米載體上再與突變 Raf 基因連接，該突變Raf 基因可以阻斷多種生長因子激發(fā)的內(nèi)皮信號轉(zhuǎn)導和血管生成，整合素 v 3 具有對內(nèi)皮系統(tǒng)的靶向性，用該三元復合物注射荷瘤小鼠，導致了腫瘤相連內(nèi)皮系統(tǒng)的凋亡，最終導致腫瘤細胞凋亡，并持續(xù)抑制原發(fā)及轉(zhuǎn)移病 灶 [54]。把抗 JLI 單克隆抗體連接于多糖修 飾的 PLL 上再與 DNA 復合所形成的三元復合物，具有對含有該抗原的未成熟的皮質(zhì)胸腺細胞的靶向性，可以用于白血病的治 療 [52]。低密度脂蛋白（ LDL）與高分子以及 DNA 所形成的三元復合納米體系實現(xiàn)了對平滑肌細胞的靶向性，該體系的轉(zhuǎn)染效率要高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectin。金納米粒用季銨鹽修飾后在 10%血清和 100mmol/L 氯喹存在下有效地把質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)入 293T 細胞，最高轉(zhuǎn)染效 率是廣泛使用的轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞氨的 8 倍 [51]。 Luo 等人用致密的硅納米粒把 DNA載體復合物以單分子層濃縮于細胞表面，提高了轉(zhuǎn)染效率 倍 [50]。采用共聚物作為轉(zhuǎn)導載體時， DNA 的轉(zhuǎn)導效率較采用單聚物時高，并在一定范圍內(nèi)共聚物中 HPMA 的含量提高有利于 DNA 轉(zhuǎn)導效率的 提高 [48]。 DNA共聚物的復合物對核酸酶有較好的抗性，且這種抗性隨共聚物的組成變化較小。雖然到目前為止，與陽離子脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)導相比，該方法的最大轉(zhuǎn)導效率仍然較低，但其長時間的表達效率（ 7 至 28 天）卻為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導法的 10~100 倍。這種方法與直接注入裸露的 DNA 相比，其堿性磷酸酶基因的表達效率有很大提高。他們認為，這種方法可以用于大通量基因功能篩 選 [46]。日本的 Honma 傷治療臨床中證明，改性膠原是安全可靠的外源基因?qū)胼d體，他們又用改性膠原與 cDNA 復合制成納米粒，預先涂敷于微孔培養(yǎng)板孔中，再接種哺乳動物細胞，在不加任何轉(zhuǎn)導試劑的前提下，這些納米復合物能夠有效地轉(zhuǎn)入細胞，并實現(xiàn)長期表達，不出現(xiàn)外源基因整合到受體細胞的染色體中的現(xiàn)象。用此方法在人類氣管上皮細胞（ 9HTEo）中轉(zhuǎn)導囊性纖維化調(diào)節(jié)因子 (CFTR)的編碼基因，有 50%的細胞表達了 CFTR，而且缺乏 CFTR 介導的氯轉(zhuǎn)運的人類支氣管上皮細胞 (IB31)，用該基因轉(zhuǎn)導后的轉(zhuǎn)化體獲得了氯轉(zhuǎn)運 能力 [44]。目前，人們在該領(lǐng)域已經(jīng)進行了不少研究，主要用天然的或者具有生物相容性、生物可降解的高聚物納米粒作為載體介導外源 DNA 分子的轉(zhuǎn)導。另一種系統(tǒng)是脂質(zhì)體介導的 DNA 轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，其特點為轉(zhuǎn)導效率高、毒性小、無潛在感染及能使目標基因轉(zhuǎn)移到特定組織等。一方面，要盡可能多地將外源基因?qū)氲桨屑毎?，以提高該區(qū)域的外源基因濃度；另一方面，進入受體細胞的外源基因必須能夠抵抗核酸酶的分解作用，并能在一段較長的時間內(nèi)發(fā)揮作用。到目 前為止，已經(jīng)應用天然的或合成的介質(zhì)如聚乙烯醇、聚丙烯酯、多糖衍生物（淀粉、果膠和藻酸鹽）等合成了一批新型的磁性納米粒，進行基因轉(zhuǎn)導、靶向給藥以及 DNA 的提取 [43]等。電擊法則是應用納米技術(shù)在受體細胞膜上形成納米級孔洞，使之成為 DNA進入受體細胞的通道?；驑尫ǖ膶嵸|(zhì)是納米或微米級的子彈荷載 DNA 分子，以高速穿透細胞膜，從而將 DNA 分子運載進入細胞染色體 DNA 中。 在 DNA 轉(zhuǎn)導中的應用 在基因轉(zhuǎn)導過程中外源基因及其構(gòu)建體多為納米尺度的 DNA 分子，因此這種轉(zhuǎn)導實際上 大多涉及到納米技術(shù)。這樣，將有 1/4 的得到整合的轉(zhuǎn)基因鼠，即轉(zhuǎn)入基因可以和正常基因一樣分離。將這些胚胎移植到假孕的母鼠子宮內(nèi)，這樣產(chǎn)生的部分子代的生殖細胞就是由轉(zhuǎn)基因的 ES 細胞形成的。通常采用一種叫正 負選擇 384 的策略來富集整合正確的 ES 細胞，即首先用正選擇的方法挑選所用整合 DNA 的 ES 細胞，再用負選擇方法淘汰整合錯誤的細胞。轉(zhuǎn)入基因必需要整合在基因組中可以進行轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。 用于 ES 細胞的 DNA 載體一般帶有定點整合元件。這樣，將基因轉(zhuǎn)入并整合到 ES 細胞基因組內(nèi)的某一非必要基因位點上，然后對這些細胞進行篩選培養(yǎng)，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。 ES 細胞在 無飼養(yǎng)層的平板中培養(yǎng)會持續(xù)分化成肌細胞、神經(jīng)細胞等多種專門功能的細胞，只有在含有成纖維細胞的飼養(yǎng)層或含有白血病抑制因子的飼養(yǎng)層上生長時才能保持其未分化狀態(tài)并保持 ES 細胞的潛在分化能力。 2．胚胎干細胞法 胚泡發(fā)育期的胚細胞是可以人工培養(yǎng)增殖的，當把這種胚細胞重新導入另一胚泡期的胚之后，它仍然保持著分化成其它類型細胞的能力，這種細胞叫做多功能胚胎干細胞，簡稱 ES 細胞。 圖 133 電擊法基因轉(zhuǎn)移模式圖 [40] 影響電擊法基因轉(zhuǎn)導效率的因素很多，如電壓電場強度、電脈沖波形、脈沖持續(xù)時間 、電融合緩沖溶液的滲透壓、細胞類型、細胞緩沖液的介質(zhì)阻抗、 DNA 分子的組成形式 等 [41]。細胞膜的可逆電穿擊現(xiàn)象不同于膜的力學破裂，其效應完全是可逆的。細胞在緩沖液中懸浮，好像是一種絕緣的由雙面含有水溶液的細胞組成的結(jié)構(gòu)，施加電場后則會使細胞膜上的電荷分離，于是產(chǎn)生了橫跨膜的電位差，異性電荷在細胞膜上相互吸引，使細胞膜變薄，在某一臨界電場強度下，引起細胞膜的破裂和氣孔的形成，使遺傳基因轉(zhuǎn)移到細 胞中去。 1990年 Chang 等用快速冰凍蝕刻揭示了細胞電穿孔的動力學過程。李克勤等 [39]則利 用電擊法將人組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 1在 Pichia pastoris 酵母中重組表達。 He 等 [10,40]利用 該方法成功的進行了硬粒小麥與大麥雜交種及面包小麥的遺傳轉(zhuǎn)化，得到了外源基因正確表達的轉(zhuǎn)基因植株。電穿孔的脈沖參數(shù)和過程容易控制，強度適當?shù)碾娒}沖不會使 DNA 和受體細胞受到任何損害，因此電擊法是一種很有前途的基因轉(zhuǎn)導方法。電擊法則較好地解決了這些問題。許多真核與原核生物由于沒有合適的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，無法進行有效的遺傳操作。 Pinnadunege 則認為最可能的機制是通過細胞的吞噬作用，即脂質(zhì)體和 DNA 的復合物被吞噬進入細胞內(nèi)和溶酶體，然后陽離子脂質(zhì)體在該處破裂而將 DNA 釋放使之進入細胞漿。 脂質(zhì)體介導 DNA 進入細胞的機制目前尚不十分清楚。其中脂質(zhì)體與 DNA 的比例 382 對于轉(zhuǎn)導效率至關(guān)重要，而且受體細胞的種類不同，兩者的比例也隨之改變。目前認為陽離子脂質(zhì)體與 DNA 有如下幾種作用形式： ① DNA 靠靜電吸引力結(jié)合在陽離子脂質(zhì)體的外表面； ② 帶負電的 DNA 完全進入脂質(zhì)體內(nèi)部； ③ 線型 DNA 的周圍包圍著脂雙層結(jié)構(gòu)， DNA 與脂質(zhì)分子之間靠靜電吸引而相互作用，但此時的脂質(zhì)體已不具備完整性，脂分子呈線性排列在 DNA 的周圍。他們在 DNA 脂質(zhì)體復合物轉(zhuǎn)導細胞的同時，加入由DOPE/DCChol 組成的空白陽離子脂質(zhì)體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當加入一定量的空白脂質(zhì)體后，其轉(zhuǎn)導效率最大可增加 8 倍。 DOPE 是一種最 重要的輔助脂。后者是陽離子脂質(zhì)體的功能部位，它們與 DNA 的磷酸基結(jié)合或與細胞膜脂帶負電荷的部分結(jié)合。 目前已合成的陽離子脂質(zhì)體不少于 20 余種，其基本結(jié)構(gòu)都由兩部分組成。由 DOTMA 構(gòu)成的脂質(zhì)體可與 DNA 自發(fā)形成復合物，其結(jié)合率可達 100%。最初用作基因載體的脂質(zhì)體是由天然磷脂如卵磷脂、腦磷脂及膽固醇所構(gòu)成的中性或帶陰離子電荷的陰離子脂質(zhì)體，使用時將質(zhì)粒 DNA 包入脂質(zhì)體內(nèi)部，但包封率較低，因而容易被溶酶體溶解破壞。與其它方法相比，脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)導的優(yōu)點在于經(jīng)脂質(zhì)體包裹的外源基因具有高效、無潛在感染及能使目標基因定向轉(zhuǎn)移到特定組織的優(yōu)勢。關(guān)于脂質(zhì)體的論述詳見本書第六章， 20 世紀 70 年代后期， Robert 等將細菌質(zhì)粒 DNA 包入脂質(zhì)體，由此開始了脂質(zhì)體在分子生物學領(lǐng)域的新應用。由于脂質(zhì)體是由可生物降解的磷脂組成的雙分子層結(jié)構(gòu)，所以與生物膜有較大的相似性和組織相容性。如圖 132 所示，脂質(zhì)體的這種結(jié)構(gòu)使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩親的外源物質(zhì)。它是一 種人工制備的類脂質(zhì)的小球體，由一個或多個類似于細胞膜的類脂雙分子層包裹著水相介質(zhì)組成。與基因槍法等直接轉(zhuǎn)化法相比，農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化有以下優(yōu)點 [35]： ① 該轉(zhuǎn)導系統(tǒng)是天然的遺傳工程系統(tǒng)，其轉(zhuǎn)化成功率高，效果顯著； ② 操作簡便，不需要特 殊的儀器設備； ③ 可轉(zhuǎn)導特定的 DNA 片斷，