【正文】 這表明所加入的寡核苷酸分子基本上結(jié)合在納米粒凝膠上。 圖 511 負(fù)載寡核苷酸的納米粒凝膠的 圖 512 負(fù)載寡核苷酸的納米粒凝膠的 Zeta 電勢(shì)與 N/P 比值的關(guān)系 平均粒徑與 N/P 比值的關(guān)系 隨著 寡核苷酸負(fù)載的增加， Zeta 電勢(shì)是下降的。兩種溶液的比例關(guān)系定義為 N/P（即納米粒凝膠中 總氮摩爾數(shù)與寡核苷酸溶液中總磷摩爾數(shù)之比）。 3．寡核苷酸在聚合物納米粒凝膠上的負(fù)載 [13] 將凍干的聚乙二醇 /聚乙烯亞胺納米粒凝膠按 10mg/mL 濃度，經(jīng)超聲處理 30 分鐘，重新分散在 的磷酸緩沖液中。納米粒可以用 PLGA、聚ε 己內(nèi)酯、聚羥基丁酯等。然后，將 5mL 50%的乙醇加入聚合物 /DDAB 液 / DNA 混合液中，形成負(fù)載 質(zhì)粒 DNA 的納米懸浮混合液。質(zhì)粒 DNA是從大腸桿菌（ ， strain DII5 alpha）中得到，采用改性的氯化銫分離技術(shù)，然后以 1mg/mL濃度懸浮于水中。制備過(guò)程如下：丙交酯 /乙交酯共聚物（ PLGA， 75:25）溶于 三氟乙醇時(shí)間（ h） 149 （ TFE），濃度為 。圖 510 顯示了納米粒中釋放出來(lái)的游離 DNA 量。32P 標(biāo)記質(zhì)粒 DNA 進(jìn)入 PLGA 納米粒的百分量如圖 59 所示。納米粒尺寸和多分散性可以用準(zhǔn)彈性光散射法測(cè)定，納米粒尺寸也可以用透射電鏡進(jìn)一步確證。 148 另外，吸附于納米粒表面上的修飾物，可以防止被特定細(xì)胞表面識(shí)別，故能用于靜脈給藥。用于制備這類納米粒的高分子材料包括 丙交酯 /乙交酯共聚物（ PLGA）、 聚ε 己內(nèi)酯、聚羥基丁酯和其它聚酯類。一般制備過(guò)程中是將聚合物溶解于含凝結(jié)劑和藥物的溶劑中（如三氟乙醇， TFE），再加入非溶劑使其沉淀出來(lái)。 一般說(shuō)來(lái)，這些納米粒都在 150nm 以下，并且至少 30%的納米粒都在 100nm 以 下。納米控釋系統(tǒng)在體內(nèi)同樣能保護(hù)寡核苷酸，防止降解， 例如 將 33PpdT16 特異地輸送到肝臟， 可 減少其在腎和骨髓中的分布。 有 研究 表明，負(fù)載 寡核苷酸 的 聚氰基丙烯酸烷基酯納米粒，無(wú)論在緩沖液還是在細(xì)胞培養(yǎng)基中，結(jié)合在納米粒上的寡核苷酸都具有對(duì)抗核酸酶的作用，防止了核苷酸的降解，并通過(guò)細(xì)胞對(duì)納米粒的吞噬作用而增加了寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的量，同時(shí)增強(qiáng)了其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。其優(yōu)勢(shì)是高分子體系的穩(wěn)定性、易處理性。因此， 基因 的 輸送 也 是對(duì) 載藥系統(tǒng)研究領(lǐng)域 的一個(gè)挑戰(zhàn) 性任務(wù)。在含有富馬酸酐齊聚物和氧化鐵添加劑的 PLGA 納米粒中， %的胰島素鋅口服具有活性，同樣具有控制血糖水平的功能。 應(yīng)用相轉(zhuǎn)變納米包囊技術(shù)，胰島素也成功包裹在不同的聚酯和聚酸酐納米粒上。與胰島素的水溶液噴霧相比，通過(guò)霧化法把 PLGA 納米粒的水分散體輸送到豚鼠中， 48 小時(shí)后，血糖水平明顯降低。 還有報(bào)道采用自乳化 /溶劑置換技術(shù)，制備了負(fù)載 PGDF 受體 β （ PGDFRβ）、 AG1295 的聚乳酸納米粒，并研究了它們的釋放動(dòng)力學(xué)、體外釋放速率以及納米粒尺寸的影響。在這些研究中，最初是將牛血清白蛋白（ BSA）負(fù)載在聚乙烯醇（ PVA）納米粒上，其后是負(fù)載在 PLGAPVA復(fù)合物納米粒上。此外 ,蛋白類藥物從 PLGA基體中釋放時(shí)，存在一個(gè)爆釋現(xiàn)象。為了解決這些問(wèn)題，對(duì)于多肽類藥物的安全而可控靜脈內(nèi)給藥，人們提出了生物降解納 米粒為載體的載藥系統(tǒng)。又由于肽的生物半衰期很短，故需頻繁給藥。然而多肽藥物在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制，這是由于肽在胃腸里被蛋白酶迅速降解。這種反應(yīng)在化學(xué)中已經(jīng)研究得比較成熟。再將此復(fù)合物按一般納米粒制備方法制成納米劑型。為了克服上述缺點(diǎn)，美國(guó)專利提出，在紫杉醇或紫杉萜的 2羥基或者 7羥基處（見(jiàn)圖 58）與水溶性聚合物（如聚谷氨酸，聚天冬氨酸）反應(yīng)。 制備水溶性的紫杉醇通常在紫杉醇的 2羥基或者 7羥基處引入可溶性基團(tuán)（見(jiàn)圖 58），如琥珀 146 酸鹽和氨基酸得到紫杉醇前藥。事實(shí)上，通過(guò)靜脈將藥物紫杉醇注射到大鼠體內(nèi)的急性致死毒性主要是由聚 氧乙基化蓖麻油所引起的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)某些毒副作用，包括血管舒張、呼吸困難和血壓過(guò)低都?xì)w因于聚氧乙基化蓖麻油。 典型的紫杉醇制劑是一種聚氧乙基化蓖麻油（ Cremophor EL）和無(wú)水乙醇的濃縮液（每毫升含有6 毫克的 紫杉醇 ），在使用之前必須稀釋。對(duì)子宮癌和乳腺癌、小核細(xì)胞和 大核細(xì)胞肺癌、腦瘤、頸瘤和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤等有明顯的效果。這一點(diǎn)可從二者的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異得到解釋：二咪那嗪醋酸酯的分子結(jié)構(gòu)上含有更多的胺基，因而具有更高的電荷密度，這有利于增強(qiáng)與聚天冬氨酸的相互作用。而對(duì)二咪那嗪醋酸酯來(lái)說(shuō)則是放熱過(guò)程。通過(guò)等溫滴定微量熱的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)兩種藥物與聚天冬氨酸復(fù)合物的熱行為不同。而另一種陽(yáng)離子水溶性藥物，二咪那嗪醋酸酯（一種抗寄生蟲(chóng)藥）的載藥量從 %增加到 %，包封率從 %增加到 %。 這是由于陽(yáng)離子的藥物與聚天冬氨酸結(jié)構(gòu)上的羧基發(fā)生靜電相互作用，增加藥物與聚合物基體的結(jié)合性。 左： 2%載藥量；中： 4%載藥量；右 ： 10%載藥量。圖 57 為不同載藥量的 PLGA 納米粒的 TEM 照片。這可能歸因與鹽酸普魯卡因在 時(shí)的離子化程度（溶解性）的改變，在 僅有 %的鹽酸普魯卡因離子化，而在 時(shí)，其離子化程度高達(dá) 99%。水相 pH 值的增加，將導(dǎo)致鹽酸普魯卡因溶解性的降低。精確稱取 D， L聚丙交酯 /乙交酯共聚物（ PLGA） 50mg 以及特定量的藥物鹽酸普魯卡因溶于 5 mL 的乙睛中，在室溫、攪拌下，將此有機(jī)相混合物滴加至 15 mL 水相中，維持?jǐn)嚢柚钡接袡C(jī)溶劑完全揮發(fā)。 制備方法是采取溶劑置換法（納米沉淀法）。相應(yīng)的包封率在 5%~14%左右。 表 52 部分脂溶性藥物在聚合物膠束上的負(fù)載 藥物 聚合物膠束 粒徑 （ nm） 文獻(xiàn) 兩性霉素 B PEO聚芐基天冬氨酸（ PBLA） 26 [16] 反義寡核苷酸 PEO聚賴氨酸 P(Lys) 50 [17] 順鉑 PEO聚 天冬氨酸 P(Asp) 16 [18] 吲哚美辛（鎮(zhèn)痛消炎藥） PEO聚己內(nèi)酯（ PCL） 145~165 [19] 安息香酸碘衍生物 PEO聚賴氨酸 P(Lys) 80 [20] 質(zhì)粒 DNA PEO聚賴氨酸 P(Lys) 140~150 [21] 阿霉素 （ DOX） PEO聚芐基天冬氨酸（ PBLA） 37 [22] 水溶性藥物 鹽酸普魯卡因 [23]是一種水溶性藥物。據(jù)報(bào)道，在靜脈給藥幾小時(shí)后，仍可從血漿中檢測(cè)到完整的聚合物膠束。 聚合物膠束負(fù)載的脂溶性藥物，對(duì)于靶細(xì)胞或組織具有較高的傳遞效率，因此可降低在正常組織中的滯留，從而降低其毒副作用。 聚合物膠束負(fù)載的脂溶性藥物見(jiàn)圖 56 圖 56 聚合物膠束負(fù)載脂溶性藥物的示意圖 144 理論上，負(fù)載在聚合物膠束上的抗癌藥物可用于各種給藥方式。 圖 55 膽酸鈉濃度與聚合物納米粒的粒徑、 Zeta 電勢(shì)的關(guān)系（數(shù)據(jù)源自文獻(xiàn) [15]）。膽酸鈉濃度為 1%~5%時(shí)，粒徑約為 280 nm 左右。分離得到的產(chǎn)物在超聲池中用水再分散，然后冷凍干燥。然后在 24000r/min， 4℃離心 20 分鐘。 2．自乳化溶劑擴(kuò)散法（ SESD） 在 250r/min 轉(zhuǎn)速攪拌下，將 125mg 的聚己內(nèi)酯和 20mg 的 Rolipram 溶于 6mL 丙酮中 , 再滴加 4 mL乙醇。 PVA 濃度為 4%時(shí)，粒徑約為 600nm 左右。未包封的藥物和游離的 PVA（或膽酸鈉）經(jīng)無(wú)離子水透析 12 小時(shí)后被分離。在 2 107Pa的壓力下，循環(huán) 3 分鐘。由于 Rolipram 的親脂性，在制備納米藥物時(shí)，可采用兩種方法： 143 1．高壓乳勻法（ PHE） 在 250 r/min 轉(zhuǎn)速攪拌 下，將 20mg 的 Rolipram 溶于 10mL 含有 125mg 的聚己內(nèi)酯的氯甲烷中。 Rolipram 是一種特效靜脈注射型磷酸二酯酶抑制劑，初期被用于抗鎮(zhèn)靜（抗精神失常）藥。但是，在保護(hù)納米粒經(jīng)過(guò)胃腸道不被分解方面，高分子表面活性劑更為有效。膽酸鈉是一種生物相容性良 好的陰離子表面活性劑，以往曾用于制備固體脂質(zhì)納米粒（ SLN）。如果納米粒表面帶有較強(qiáng)的負(fù)電荷，這對(duì)納米藥物體系在炎癥部位的駐留是有利的。文獻(xiàn)上曾報(bào)道采用聚己內(nèi)酯，這是一種具有生物相容性和可生物降解性的合成聚合物。另外納米載藥系統(tǒng)在炎癥部位的停留時(shí)間比常規(guī)藥物明顯增加，因此可相應(yīng)減少藥物劑量。在這個(gè)范圍內(nèi)，載體顆粒在結(jié)腸炎癥組織中的沉積量是無(wú)炎癥組織中的5~ 倍。而藥物載體顆粒尺寸在微米或納米尺度時(shí)將極大改善這種現(xiàn)象。為避免這些副作用，過(guò)去曾采用固體劑型使藥物在結(jié)腸釋放。 脂溶性藥物 腸炎是一類常見(jiàn)病。前者的 阿霉素包封率為 %，載藥率為 %。 除了包埋法和吸附法外， Yoo等 [14]報(bào)道了水溶性藥物的負(fù)載新方法，在這種方法里，藥物是以化學(xué)鍵的方式結(jié)合在納米粒上。大黑點(diǎn)表示藥物；斜線區(qū)域表示納米粒的基體；小黑點(diǎn)區(qū)域表示表面活性劑。因此，對(duì)包囊藥物來(lái)說(shuō)，需要找到一個(gè)最佳聚合單體的量。一般說(shuō)來(lái)，聚合物分子結(jié)構(gòu)中烷基鏈越長(zhǎng)，對(duì)藥物的親和性就越強(qiáng)，因此吸附量與聚合物的疏水基和納米粒的特定區(qū)域有關(guān)。從納米粒 /藥物體系的吸附等溫線可得到一些關(guān)于設(shè)計(jì)載藥系統(tǒng)的重要信息，如納米粒表面藥物結(jié)合能力和被吸附的藥物量。大 多數(shù)藥物是采用前一方法與納米粒載體結(jié)合。 141 表 51 聚合物納米粒制備方法 聚合物 適用的制備方法 聚烷基甲基丙烯酸酯 乳液聚合、溶劑置換法、鹽析法 聚烷基氰基丙烯酸酯 乳液聚合、界面聚合 聚苯乙烯 乳液聚合 聚乙烯基吡啶 乳液聚合 聚丙烯醛 乳液聚合 聚戊二醛 乳液聚合 聚賴氨酸衍生物 界面聚合 聚乳酸 乳化蒸發(fā)、溶劑置換法、鹽析法、乳化擴(kuò)散 聚乙交酯 /丙交酯共聚物 乳化蒸發(fā)、溶劑置換法、鹽析法、乳化擴(kuò)散 聚ε 己內(nèi)酯 乳化蒸發(fā)、溶劑置換法 聚β 羥基丁酸酯 乳化蒸發(fā) 乙基纖維素 乳化蒸發(fā)、鹽析法 聚乙二醇 /聚乙烯亞胺納米粒凝膠 乳化蒸發(fā) 藥物在聚合物納米粒上的負(fù)載 一個(gè)好的納米載藥系統(tǒng)應(yīng)具有較大的載藥量和較高的包封效率，以減少整個(gè)載藥系統(tǒng)中載體的用量和藥物的浪費(fèi)。 納米粒凝膠與寡核苷酸的結(jié)合及其有關(guān)研究見(jiàn)后述。較大的顆?？赏ㄟ^(guò)離心分離，懸浮液再經(jīng)水透析 24 小時(shí)。所得的白色乳液在減壓下蒸出溶劑，產(chǎn)物為均勻的微乳白色懸浮液。然后加水并在水中透析 24 小時(shí)，再經(jīng)凍干處理。一般過(guò)程如下： 首先制備雙活性端基的 PEG。 由于 PEI 帶正電荷，因此這種納米粒凝膠能與帶負(fù)電荷的分子作用，如寡核苷酸、蛋白、表面活性劑等。 納米粒凝膠的尺寸范圍在 20nm~220nm之間，而由 傳統(tǒng)的聚合物水凝膠制備的微球的 尺寸范圍在 m~500μ m之間。據(jù)稱，這種納米粒凝膠與其他聚合物納米粒相比，能顯著增強(qiáng)藥物的控制釋放特性。類脂化合物的存在將增加聚合物膠束的體外穩(wěn)定性，這是因?yàn)轭愔衔锏闹；鶑?qiáng)化了膠束內(nèi)核聚合物鏈之間的疏水相互作用。聚合物膠束的粒徑及其分布可由光散射法直接測(cè)得，也可由原子力顯微鏡（ AFM）、透射電鏡（ TEM）和掃描電鏡（ SEM）測(cè)得。 140 這類聚合物膠束的粒徑隨著溫度的升高會(huì)迅速增大，直至高于 LCST 時(shí)沉淀。其粒徑大小取決于聚合物相對(duì)分子質(zhì)量、親水 /疏水鏈的比例以及它們的聚集數(shù)。當(dāng)疏水端基發(fā)生締合時(shí)，疏水鏈周圍的水分子簇從疏水核內(nèi)被排除。膠束尺寸的大小除與鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)外，另一主要因素是疏水相互作用。 兩親性聚合物可以形成兩種不同類型的膠束，如圖 53 所示，一種是疏水鏈無(wú)規(guī)地接枝在親水聚合物上，另一種是親水 /疏水二嵌段型共聚物。但是臨界膠束濃度（ CMC）要比小分子表面活性劑的 CMC 低得多。另外，載體的生物分布也與親水性外殼的性質(zhì)有關(guān)。左：二嵌段型共聚物；右：接枝型共聚物。圖 53 為聚合物膠束的示意圖。多嵌段型共聚物，如 PEOPPOPEO（三嵌段型）也能聚集成為膠束。 聚合物膠束是一種核 殼型結(jié)構(gòu)，目前的研究主要集中在具有 AB 結(jié)構(gòu)的二嵌段型共聚物。聚合物膠束作為一種納米藥物載體，近來(lái)也受到極大關(guān)注。由這樣的聚合物制備的納米粒不需要加入溶劑或表面活性劑。 另一種新型的親水性聚合物是可生物降解的聚酯，這種聚酯是由接枝在聚乙烯醇 (PVA)，或電荷改性的丁基磺酸 聚乙烯醇 (SBPVA)上的短鏈聚內(nèi)酯組成，它們是在 不同的多元醇存在下，通過(guò)丙交酯和乙交酯的本體熔融聚合反應(yīng)制備而來(lái)的。實(shí)驗(yàn)表明，在負(fù)載免疫性的和抗腫瘤的蛋白質(zhì)方面，殼聚糖納米粒比明膠納米粒更好。實(shí)驗(yàn)表明，這些納米粒與蛋白質(zhì)的結(jié)合性良好，如牛血清蛋白 (BSA)、破傷風(fēng)毒素、 dipthaheria 類 毒素、胰島素和低聚核苷酸。這種方法涉及離子凝膠化，是兩種水相的混合物：一種水相含有殼聚糖和二嵌段的氧化乙烯（ EO） /氧化丙烯（ PO）共聚物；另一種水相含有聚陰離子 ， 三聚磷酸鈉 (TPP)。 圖 52 氰基丙烯酸烷基酯的陰離子型聚合制備納米粒藥物載體示意圖 7．由親水性聚合物制備納米粒 親水性聚合物如殼聚糖、明膠和藻酸鈉等也可用來(lái)制備納米粒。