【正文】 吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞。 表 72 已商品化的陽(yáng)離子脂質(zhì)體 陽(yáng)離子脂質(zhì)體 組成成分 廠商 Lipofectin DOTMA/DOPE=1： 1（質(zhì)量比） GIBCO BRL DOTAP DOTAP Boehringer、 Mannheim TransfectACE DDAB/DOPE=1： 3（摩爾比） GIBCO BRL LipofectAMINE DOSPA/DOPE=1： 1（質(zhì)量比） GIBCO BRL Transfectam DOGS Promega TfxTM50 TfxTM50/DOPE Promega DCChol DCChol/DOPE=1： 1（摩爾比） Sigma 陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的機(jī)制 自 1987 年首次應(yīng)用陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移基因取得成功以來(lái)，陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的研究取得了一系列的進(jìn)展。由 SA 和 DOPE 按質(zhì)量比 1:1 制備的脂質(zhì)體是目前已知的完全由天然脂質(zhì)體所構(gòu)成的陽(yáng)離子 納米脂質(zhì)體，它對(duì)機(jī)體的免疫原性小，可能今后會(huì)在基因治療上得到較好的應(yīng)用。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因被認(rèn)為是在復(fù)合物形成過(guò)程中， DNA 會(huì)誘使 SUVs 向 MLVs 轉(zhuǎn)化。 曾有研究表明，在脂質(zhì)組成一定的情況下， MLVs 與 DNA 形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率要高于 SUVsDNA 復(fù)合物 [14]。 多層納米脂質(zhì)體（ multilamellar vesicles， MLVs）： MLVs 是由雙分子層與水交替形成的 6 囊泡。按脂質(zhì)體的大小和脂質(zhì)雙層數(shù)目可將納米脂質(zhì)體分為以下幾類： 小單層納米脂質(zhì)體（ small unilamellar vesicles， SUVs）： SUVs 是具有脂質(zhì)雙分子層的最小單位，其大小根據(jù)介質(zhì)的離子強(qiáng)度和膜的脂質(zhì)組成不同而不同，一般在 20 nm~100 nm 之間。脂質(zhì)體的直徑約在 25 nm~1000 nm 范圍內(nèi)，甚至更大。 此外，加人大相對(duì)分子質(zhì)量的陽(yáng)離子聚合物，如聚賴氨酸（ PLL）或硫酸魚精蛋白，可減小復(fù)合物的粒徑，有效避免 DNA 被核酸酶降解，從而提高轉(zhuǎn)染效率 [12,13]。這正是 DOPE 成為“脂質(zhì)伴侶”的原因 [11]。目前最常使用的脂質(zhì)體，如 DOTMA/DOPE 脂質(zhì)體、 DOSPA/DOPE 脂質(zhì)體、DDAB/DOPE 脂質(zhì)體都含有 DOPE，其中 DOTMA、 DOSPA、 DDAB 作為陽(yáng)離子脂質(zhì)靠靜電作用與核苷酸結(jié)合，而 DOPE 則作為可融性脂質(zhì)促進(jìn)陽(yáng)離子脂質(zhì)與細(xì)胞膜的融合。該脂質(zhì) 在陽(yáng)離子脂質(zhì)體與 DNA 形成復(fù)合物、復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞、復(fù)合物從內(nèi)涵體脫離以及 DNA 與陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體分離的過(guò)程中都起著重要的作用。 2 輔助脂質(zhì) 輔助脂質(zhì)主要有磷脂酰乙醇胺（ PE）、磷脂酰膽堿（ PC）、膽固醇（ Chol）等。將膽固醇用作疏水烴尾，效果常常優(yōu)于脂肪鏈，因?yàn)橛伤鼌⑴c形成的雙分子層結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。脂肪烴基鏈的碳原子數(shù)通常為 12 至 18 個(gè)，以達(dá)到在生理溫度下為脂雙層提供足夠的流動(dòng)性，又能使脂雙層膜維持一定的剛性，以便為陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體在體內(nèi)的脂質(zhì)融合創(chuàng)造條件。通常采用的連接鍵是化學(xué)穩(wěn)定性較高、但又可以生物降解的酰胺鍵和氨甲酰鍵等。 連接鍵是類脂分子很重要的組成部分，它決定了陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體的化學(xué)穩(wěn)定性和生物可降解性。 連接鏈的長(zhǎng)度能影響陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體與粘膜表面的相互作用，從而影響轉(zhuǎn)染活力。在陽(yáng)離子膽固醇衍生物中，帶有叔胺基團(tuán)的陽(yáng)離子膽固醇化合物比季銨鹽化合物有更高的轉(zhuǎn)染活力，并且毒性小得多。 陽(yáng)離子脂質(zhì)的頭部 大都包含胺類基團(tuán)（除一種脂質(zhì)含脒基外），從簡(jiǎn)單的氨基到被甲基或羥乙基團(tuán)取代的季銨鹽。下面將分別對(duì)一些常見的陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)和脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行介紹。 目前使用的陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體通常由一種陽(yáng)離子脂質(zhì)和一種中性輔助脂質(zhì)在適當(dāng)?shù)臈l件下復(fù)合而成 [7]。 1989 年將該轉(zhuǎn)染試劑用于 RNA 的轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)其可高效轉(zhuǎn)移 RNA 到人、鼠等多種動(dòng)物 細(xì)胞內(nèi)。 陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體的組成 1987 年， Felgner 等 [6]首次將等量的氯化三甲基 2, 3二油烯氧基丙基銨（ DOTMA）和二油?；字Ｒ掖及罚?DOPE）制成小單層脂質(zhì)體，即轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectin。為了解決以上問題，研究人員根據(jù)需要對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行了適當(dāng)?shù)男揎梺?lái)制備各種類型的納米脂質(zhì)體，如陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體、聚陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體、免疫納米脂質(zhì)體、融合納米脂質(zhì)體、 pH 敏感納米脂質(zhì)體和長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)體等 [15]，其中有關(guān)陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體的研究最為廣泛。 3 納米脂質(zhì)體 納米脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移有以下的優(yōu)勢(shì)： ○ 1 納米脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合將目的基因?qū)爰?xì)胞后即被降解，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用，可反復(fù)給藥； ○ 2 納米脂質(zhì)體與基因的復(fù)合容易，制備簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，易于大量生產(chǎn)； ○ 3 納米脂質(zhì)體不激活癌基因和免疫反應(yīng)； ○ 4 DNA 或 RNA與納米脂質(zhì)體復(fù)合后，不易被滅活或被核酸酶降解； ○ 5 納米脂質(zhì)體攜帶的基因可轉(zhuǎn)運(yùn)至特定部位，操作簡(jiǎn)單快速，重復(fù)性好。由于常用的 DNA 為超螺旋或開環(huán)結(jié)構(gòu)，空間體積太大，并且不能有效主動(dòng)地進(jìn)入細(xì)胞，因此必須進(jìn)行壓縮（ condensation）或利用其它分子或技術(shù) 的輔助。到目前為止，研究者們已設(shè)計(jì)了多種類型且各有特點(diǎn)的非病毒納米基因載體，主要包括脂質(zhì)體（ liposome vector）和陽(yáng)離子聚合物（ cationic polymer vector），如殼聚糖、多聚賴氨酸、樹狀大分子等。基于本書為“納米藥物”，故本章重點(diǎn)闡述與納米技術(shù)關(guān)系密切的非病毒載體。 隨著基因治療研究的不斷深入，尤其是伴隨著基因治療臨床實(shí)驗(yàn)的廣泛開展，人們已認(rèn)識(shí)到理想的基因載體應(yīng)當(dāng)具備如下特點(diǎn)：① 靶向特異性，且不被免疫系統(tǒng)識(shí)別；② 有利于基因高效轉(zhuǎn)移和長(zhǎng)期表達(dá)；③ 高度穩(wěn)定，容易制備，可濃縮和純化；④ 無(wú)毒副作用，可生物降解，對(duì)病人和環(huán)境安全無(wú)害。物理方法主要有電穿透法、顯微注射法、基因槍法和碳化硅纖維介導(dǎo)法等；化學(xué)方法主要包括磷酸鈣沉淀法、 DEAE 葡聚糖介導(dǎo)法、聚乙二醇介導(dǎo)法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法等；生物學(xué)方法主要包括以病毒（如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒和皰疹病毒等）為載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等；生物物理方法主要有電擊法和胚胎干細(xì)胞法等。 經(jīng)過(guò)近二十年的努力，各種幫助外源性基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移的方法相繼問 世。由于 人體內(nèi)只有少數(shù)幾種細(xì)胞或組織可接收直接導(dǎo)入的裸露 DNA，而其它細(xì)胞或組織對(duì)此法有抗性。 在基因治療過(guò)程中，外源基因及其構(gòu)建體多為納米尺度的 DNA 分子，因此這種轉(zhuǎn)基因方式大多涉及納米技術(shù)。例如， 1994 年美國(guó)科學(xué)家利用經(jīng)過(guò)修飾的腺病毒為載體，成功地將治療遺傳性囊性纖維化病的正?；?cfdr 轉(zhuǎn)入患者肺組織中。這種方法操作復(fù)雜，但效果較為可靠。 主要的治療途徑是體外（ ex vivo）基因治療，即在體外用基因轉(zhuǎn)染病人靶細(xì)胞，然后將經(jīng)轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞輸入病人體 內(nèi)。 廣義基因治療是指利用基因藥物的治療。這就稱為基因工程藥物。基因工程藥物因其療效好，副作用小，應(yīng)用范圍廣泛而成為各國(guó)政府和企業(yè)投資開發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域，大量的基因工程藥品連續(xù)問世，年產(chǎn)值達(dá)數(shù)十億美元。例如， EPO、GCSF、 tPA 等，在治療腫瘤等一系列疾病上取得明顯的療效。 1982 年美國(guó) Lilly 公司首先將重組胰島素投放市場(chǎng)，標(biāo)志世界第一個(gè)基因工程藥物的誕生。 1 第 7 章 納米基因藥物 概述 自 20 世紀(jì) 70 年代 DNA 重組技術(shù)誕生以來(lái)，以重組 DNA 技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展。 1976 年，世界上第一家應(yīng)用生物技術(shù)開發(fā)新藥的公司（ Gentech 公司）建立，開創(chuàng)了現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新紀(jì)元。接著，美、日、英、瑞士等國(guó)先后批準(zhǔn)了 10 余種基因工程藥品上市。 此后，以基因工程藥物為主的各種基因工 程產(chǎn)品和細(xì)胞工程產(chǎn)品層出不窮，并陸續(xù)商品化。 基因工程藥物是將目的基因用 DNA 重組的方法連接在載體上，然后將載體導(dǎo)入靶細(xì)胞（微生物、動(dòng)物細(xì)胞或人體組織靶細(xì)胞），使目的基因在靶細(xì)胞中得以表達(dá)，最后將表達(dá)的目的蛋白質(zhì)提純及做成制劑，從而成為蛋白質(zhì)藥物或疫苗?，F(xiàn)有或正在開發(fā)中的基因工程藥物大致有以下幾類：?jiǎn)慰寺】贵w、疫苗、基因治療藥物、干擾素、白介素、生長(zhǎng)因 子、重組可溶性受體、反義藥物、人生長(zhǎng)技術(shù)、組織纖溶酶原激活劑、凝血因子、集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素及超氧化物歧化酶（ SOD）等，若目的基因直接在人體組織靶細(xì)胞中表達(dá)，就成為基因治療（ Gene therapy）。通常所說(shuō)的基因治療，即狹義基因治療，是指用完整的基因進(jìn)行基因替代治療，一般用 DNA 序列 。自 1990年較成功地進(jìn)行了腺苷脫氨酶（ ADA）缺乏引起的免疫缺 陷病的人體基因治療至今， 大部分基因治療臨床試驗(yàn)都是體外基因治療， 即 先從病人體內(nèi)獲得某種細(xì)胞（例如 T 淋巴細(xì)胞），進(jìn)行培養(yǎng)，在體外完成基因轉(zhuǎn)移后，篩選成功轉(zhuǎn)移的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，然后重新輸入患者體內(nèi)。 此外，基因治療也 可以用基因藥物進(jìn)行直接體內(nèi)治療，所用的 基因藥物可以是完整基因 或 基因片段（包括 DNA 或 RNA）； 治療途徑 可以是替代治療 或 抑制性治療。這種直接往人體組織 細(xì)胞中轉(zhuǎn)移 2 基因的治病方法叫做體內(nèi)（ in vivo）基因治療。另外外源基因只有整合到細(xì)胞染色體中，變?yōu)槠渲幸徊糠植庞锌赡艿玫匠掷m(xù)的高表達(dá)。 因此，采用什么樣的手段將精心挑選的功能基因有效地轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞核與染色體整合，這是關(guān)系到基因治療成敗的關(guān)鍵。這些方法包含物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)方法。 在前述的各種轉(zhuǎn)導(dǎo)方法中，除了 電穿透法、顯微注射法、基因槍法和碳化硅纖維介導(dǎo)法等物理方法，其他各種轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)都是利用納米級(jí)載體攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，因此屬于典型的納米 操作范疇。目前應(yīng)用于基因治療的載體主要有病毒載體（ viral vector）和非病毒載體（ nonviral vector）兩種。 非病毒納米基因載體的研究在近幾年愈來(lái)愈 受到人們的重視。 非病毒納米基因載體的本質(zhì)是將基因治療中的基因看作藥物，然后從藥劑學(xué)和生物藥劑學(xué)的角度來(lái)考慮如何把基因?qū)氚屑?xì)胞或組織、器官并進(jìn)行表達(dá)。 DNA 分子在加入諸如多價(jià)陽(yáng)離子（ Ca2+、Co3+、 La3+等）、脂質(zhì)體、陽(yáng)離子聚合物、酒精或堿性蛋白后通過(guò)壓縮過(guò)程可以組裝成高度有序的結(jié)構(gòu)，使體積縮小為原來(lái)的百分之一以下，從而可以有效地進(jìn)入細(xì)胞并進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 納米脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移面臨的主要問題是脂質(zhì)體對(duì)靶細(xì)胞缺乏識(shí)別能力，基因透過(guò)細(xì)胞膜的能力較低，以及脂質(zhì)體在血漿中的穩(wěn)定性較差。本節(jié)重點(diǎn)介紹陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體（ cationic nanoliposome） 。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此轉(zhuǎn)染試劑可有效地用于 DNA 轉(zhuǎn)染。這一發(fā)現(xiàn)大大促進(jìn)了陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為一類新型高效基因載體的廣泛應(yīng)用研究。陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)基因的效率與陽(yáng)離子脂質(zhì)的組成密切相關(guān) [8]。 1 陽(yáng)離子脂質(zhì) 陽(yáng)離子脂質(zhì)分子在結(jié)構(gòu)上由四個(gè)部分組成：一個(gè)或多個(gè)陽(yáng)離子頭部（ head）、連接鏈（ spacer）、連接鍵（ linker bond）和疏水烴尾（ hydrophobic tail）。陽(yáng)離子脂質(zhì)的極性頭起著脂質(zhì)體與 DNA、脂質(zhì)體 DNA 復(fù)合物與細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)其它組分相互結(jié)合的作用。帶有多價(jià)極性頭基 4 團(tuán)或具有多個(gè)正電荷極性頭的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率較高，這可能是因?yàn)樗c DNA 的結(jié)合較牢固。一般來(lái)說(shuō)，帶有長(zhǎng)連接鏈的陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體能顯著 增強(qiáng)與粘膜表面的相互作用，轉(zhuǎn)染效率高。醚鍵和 CN 鍵的化學(xué)穩(wěn)定性較高，但不易被生物降解，一般不適用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；含有酯鍵的陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體較易被生物降解，細(xì)胞毒性小，但它們的化學(xué)穩(wěn)定性通常較差。 常見的陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體的疏水烴尾主要有脂肪烴基鏈和膽固醇環(huán)。對(duì)以脂肪鏈為尾部的脂質(zhì)體，碳鏈加長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，但在鏈內(nèi)引入不飽和鍵可提高效率。表 71 內(nèi)列出了目前常用的一些陽(yáng)離子納米脂質(zhì) [9,10]。二油?；字Ｒ掖及罚?DOPE）是應(yīng)用最廣的一種輔助脂質(zhì)，可與陽(yáng)離子脂質(zhì)形成穩(wěn)定的納米脂質(zhì)體，與 DNA 等具有良好的融合性。因此， DOPE 已被廣泛應(yīng)用于陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中以提高基因的轉(zhuǎn)染效率。若用DOPC（二油?；字Ｄ憠A）代替 DOPE，脂質(zhì)體 的融合性下降，轉(zhuǎn)染效率也隨之降低。而以 Chol 為輔助脂質(zhì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)體雖然穩(wěn)定性提高，但轉(zhuǎn)染效率卻降低。 5 表 71 用于制備陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體的常見陽(yáng)離子脂質(zhì) 縮寫名 化學(xué)名 DOTMA 氯化三甲基 2, 3二油烯氧基丙基銨 DOTAP 溴化三甲基 2, 3二油酰氧基丙基銨 DOSPA 三氟乙酸二甲 基 2, 3 二油烯氧基丙基 2(2精胺甲酰氨基 )乙基銨 DTAB 溴化三甲基十二烷基銨 TTAB 溴化三甲基十四烷基銨 CTAB 溴化三甲基十六烷基銨 DDAB 溴化二甲基雙十八烷基銨 DORI 溴化二甲基 2羥乙基 2,3二油酰氧基丙基銨 DORIE 溴化二甲基 2羥乙基 2,3二油烯氧基丙基銨 DORIEHP 溴化二甲基 3羥丙基 2,3二油烯氧基丙基銨 DORIEHB 溴化二甲基 4羥丁基 2,3二油烯氧基丙基銨 DORIEHPc 溴化二甲基 5羥戊基 2,3二油烯氧基丙基銨 DPRIE 溴化二甲基 2羥乙基 2,3雙十六烷氧基丙基銨 DSRIE 溴化二甲基 2羥乙基 2,3雙十八烷氧