基因探針ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-01-08 00:27本頁(yè)面
【正文】 針 (Sense probe) ? 4 以不加核酸探針雜交液進(jìn)行雜交 (空白試驗(yàn) ) ? 5 組織對(duì)照用已知確定為陽(yáng)性或陰性組織進(jìn)行雜交對(duì)照。 ? 6 ? 通常用地高辛 (Dig),生物素 ,熒光素 ,同位素 ,等標(biāo)記探針 。 ? (一 ) 、地高辛 (Dig)標(biāo)記 DNA探針在石蠟切片檢測(cè)病毒DNA的方法。 ? (二 ) 、生物素標(biāo)記 DNADNA的方法。 ? (三 )、 cRNA探針檢測(cè)組織切片中的 RNA原位雜交。 ? (四 )、用寡核苷酸探針檢測(cè)組織切片中的 RNA原位雜交。 ? (五 )、用 cDNA探針檢測(cè)體外培養(yǎng)細(xì)胞中的 RNA原位雜交。 ? (六 ) 、 RNA原位雜交與免疫組化雙重檢測(cè)技術(shù)。 ? (七 ) 、多重 RNA原位雜交技術(shù)。 (雙重原位雜交是在同一標(biāo)本或同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)檢測(cè)兩種或兩種以上的靶核酸序列的技術(shù)。 ) ? (八 ) 、原位雜交的 PCR增敏法。 ? 引物原位標(biāo)記技術(shù) (Primed in situ Labeling, PRINS) ? 針對(duì)染色體的特異性 α 衛(wèi)星 DNA 序列設(shè)計(jì)和合成引物 。 ? 利用未標(biāo)記的寡核苷酸引物與變性后的染色體DNA特異結(jié)合 , 然后用熒光素標(biāo)記的脫氧核苷酸(dUTP)與未標(biāo)記的脫氧核苷酸一起在 DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸反應(yīng) ,標(biāo)記了的 dUTP將以堿基配對(duì)的形式摻入到新合成的 DNA單鏈中 , 最后用相應(yīng)的熒光抗體與標(biāo)記物結(jié)合以顯示檢測(cè)結(jié)果。 原位雜交技術(shù)應(yīng)用 ? 原位雜交技術(shù)已應(yīng)用于基礎(chǔ)研究如基因組圖(Gene mapping),轉(zhuǎn)基因檢測(cè) ,基因表達(dá)定位(localization of gene expression),核 DNA和RNA的 mRNA的排列和運(yùn)輸 (arrangement and transport of mNA),復(fù)制 (replication)和細(xì)胞的分類 (Sorting of cells)。臨床研究應(yīng)用在細(xì)胞遺傳學(xué) (Cytogeics),產(chǎn)前診斷 (Prenatal diagnosis),腫瘤和傳染性疾病的診斷 ,生物學(xué)劑量測(cè)定 (biological dosimetry)和病毒學(xué)的病原學(xué)診斷等。 ? 分子燈塔 ? 是一個(gè)用熒光標(biāo)記的核酸探針 .也叫分子信標(biāo) ,它是近幾年興起的利用核酸雜交技術(shù)對(duì)核酸分子進(jìn)行檢測(cè)的新技術(shù)。 ? 這一技術(shù)是由紐約市公共健康研究協(xié)會(huì)于 1996年首次建立的。因其在與核酸分子互補(bǔ)結(jié)合之后熒光素便能開始發(fā)光 ,故稱為“分子燈塔”。這一技術(shù)的建立為研究核酸分子的組成、含量及對(duì)ＰＣＲ過(guò)程中進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控提供了快速、特異、方便的新方法。分子燈塔作為一種核酸探針 ,不但適用于體外核酸分析 ,而且適用于活體分析 。不僅廣泛應(yīng)用于核酸分子的研究 ,還是一種極好的研究蛋白質(zhì)等能與核酸發(fā)生相互作用的物質(zhì)的工具。 ? 燈塔是一個(gè)用熒光標(biāo)記的 ,具有“發(fā)夾”樣結(jié)構(gòu)的單鏈寡聚核苷酸序列 ,一般含 20～ 30個(gè)核苷酸 ,由兩部分組成 ,即環(huán)狀部分和莖部。如圖 1所示 [1]:環(huán)狀部分為單鏈核苷酸 ,是分子燈塔的基因識(shí)別部位 ,它能與靶基因一段ＤＮＡ或ＲＮＡ ,在ＲＮＡ聚合酶的存在下特異的互補(bǔ)結(jié)合。莖部是一段由 4～ 12對(duì)堿基 (大多含有 5對(duì)堿基 )互補(bǔ)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在莖部的末端 ,即5’ 端和 3’ 端通過(guò)連接臂分別與熒光素和淬滅物質(zhì)結(jié)合。熒光素和淬滅物質(zhì)可根據(jù)研究目的的不同自行設(shè)計(jì)。 ? 分子燈塔在未與靶序列結(jié)合以前 ,以環(huán)莖結(jié)構(gòu)的形式存在 ,其莖部的雙鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)使末端的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)緊緊地靠在一起 ,二者間距離 7～ 10ｎｍ。熒光基團(tuán)EDANS在 336ｎｍ的激光下會(huì)激發(fā)出波長(zhǎng)為 490ｎｍ的藍(lán)色熒光 ,但由于淬滅基團(tuán) DABCYL與它靠得很近 ,因而發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (fluorescence resonanceenergytransfer,FRET),這樣一來(lái) ,熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光就被淬滅基團(tuán)吸收并以熱的形式散發(fā)掉 ,因而此時(shí)檢測(cè)不到熒光信號(hào)。當(dāng)有靶序列存在時(shí) ,分子燈塔的環(huán)狀部分的核苷酸序列可以與靶序列特異性地結(jié)合 ,所形成的雜交分子比分子燈塔的莖部雙鏈結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定 ,于是雜交分子的剛性使莖部的雙鏈分子分離 ,也就使得熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開 ,此時(shí) ,熒光分子發(fā)出的熒光就不能被淬滅分子吸收 ,這樣在室溫下就可通過(guò)熒光儀或合適配置的顯微鏡觀察到熒光。
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