醫(yī)學(xué)ppt課件】各種疾病的分子基礎(chǔ)-資料下載頁
2025-01-07 19:11本頁面
【正文】 ?抽取 mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成 cDNA (互補 DNA, plementary DNA)，把 cDNA複製成雙股的 DNA，再將 DNA選殖到載體系統(tǒng) ?來自 mRNA，為細(xì)胞中 『 當(dāng)時 』 能表達的基因 ?都是編碼序列，不含內(nèi)含子或重複序列 ? 基因庫中的序列片段為隨機，需要多少 DNA片段才能涵蓋整個基因組？ ?篩到基因的機率 公式： N = ln (1 P) / ln (1 –F/T) N 所需篩選的重組 clone數(shù)目 P 篩到基因的期望值 () F 單一個重組 DNA的平均片段大小 (20 kb) T 基因組大小 (3 X 109 bp) N = ln () / ln (1 – 20/3000000) = ln / ln = / = 690773 ?篩到基因的機率（原核生物為例） 公式： N = ln (1 P) / ln (1 –F/T) N 所需篩選的重組 clone數(shù)目 P 篩到基因的期望值 () F 單一個重組 DNA的平均片段大小 (5 kb) T 基因組大小 (5000 kb) N = ln () / ln (1 – 5/5000) = ln / ln = / = 4600 ?南方墨點轉(zhuǎn)印法 Southern blotting ? 1975 Edwin Southern發(fā)明 ? 利用鹼基互補的原則 ?北方墨點轉(zhuǎn)印法 Northern blotting ? 1977 Alwine修改 southern blotting發(fā)展出來 ? 也是利用 DNARNA互補的原則 西方墨點法 Western blotting ? 免疫墨點法 ? 偵測分子：蛋白質(zhì) ? 跑 SDSPAGE（分離蛋白質(zhì)） → 轉(zhuǎn)漬到纖維膜 →加一次抗體 → 加二次抗體 → 呈色 SDSPAGE 參考資料： ?聚合酶鏈鎖反應(yīng) (PCR, polymerase chain reaction) ? 在試管內(nèi)快速且大量複製 DNA的技術(shù) ? 1970 Khorana等人提出其理論 ?DNA尚不能定序 ?寡核苷酸合成不易 ? 1983 Kary Mullis等人提出實際操作方法 ?獲得 1993年諾貝爾化學(xué)獎 ? 變性 (Denaturation) ?加熱（ 95℃ ）將模版 DNA雙股分開 ? 引子黏合 (primer annealing) ?降低溫度使特異性引子黏合至單股模版 DNA的互補序列 （溫度 40 ～ 72℃ ） ? 延展 (extension) ?DNA聚合酶開始合成新股 DNA （最佳反應(yīng)溫度 72℃ ） ? 此三步驟為一個循環(huán)，一般進行 25 ～ 30個循環(huán)
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