cr引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧-資料下載頁
2025-01-06 16:38本頁面
【正文】 入反應(yīng)。例如在覆蓋有礦物油的小試驗(yàn)中， 所有反應(yīng)管的一種公共成分（如 Taq酶）可以先不加，而到第一個(gè)循環(huán)的變性階段溫度超過 80 ℃ 以后再加。 ? 最近有一種熱啟動(dòng)的方法是在加入 Taq DNA聚合酶前先在管中加入其單克隆抗體 （ Cloech 公司的 Taq Start Antibody，或者 ToYoBo公司的 Kod Plus DNA聚合酶 ）， 在溫度升高到將中和抗體變性失活之前，抗體阻遏聚合酶的活性，防止反應(yīng)開始。 非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的對(duì)策（三） ? 嵌套式和半嵌套式 PCR對(duì)于減少或消除不需要的產(chǎn)物同時(shí)提高靈敏度經(jīng)常是很成功的。 首先在常規(guī)條件下用 第一套跨越目的 DNA片段的引物擴(kuò)增 ，假象產(chǎn)物經(jīng)常會(huì)與引物中的一條或兩條配對(duì)，但其內(nèi)部卻是無關(guān)序列。 接著對(duì)一部分反應(yīng)物－產(chǎn)物混合物進(jìn)行新一輪擴(kuò)增，采用的引物與第一對(duì)引物內(nèi)側(cè)的序列配對(duì)，在這一輪擴(kuò)增中只有真正的產(chǎn)物被擴(kuò)增。這種辦法即使在目的產(chǎn)物開始用 EB染色檢測不到而且有假象帶時(shí)也常常獲得成功。 半嵌套式 PCR，只第二條引物在目的片段一端的內(nèi)側(cè)，也同樣有效。 在基因步行或企圖進(jìn)行 5‘或 3’端 RACE時(shí)，由于只有一條引物內(nèi)部的序列是已知的，經(jīng)常需要作這種變動(dòng)。 ? 采用嵌套式 PCR方法，第一、二輪擴(kuò)增在第 20個(gè)循環(huán)左右終止而不是象通常的在第 30－ 35個(gè)循環(huán)終止會(huì)獲得更好的結(jié)果 ， 這樣做減少了產(chǎn)生不需要的高分子量帶和成片產(chǎn)物的機(jī)會(huì)。 嵌套式 PCR極端敏感，在 106基因組 DNA背景中一個(gè)拷貝的病毒基因也能檢測到。 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 ? PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差， dNTP濃度過高， Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。 其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶；減少 dNTP的濃度；適當(dāng)降低 Mg2+濃度；增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 進(jìn)行多輪 PCR時(shí)， PCR產(chǎn)物 成片的原因 ? ? 進(jìn)行多輪 PCR時(shí)，如果下一輪 PCR反應(yīng)的起始模板量太大，即使 PCR條件是正常的，產(chǎn)物成片現(xiàn)象也可能會(huì)出現(xiàn)。 總的規(guī)則是如果上一輪 PCR產(chǎn)物在凝膠上見得到條帶，只能用 1??l上一輪 PCR產(chǎn)物的 1： 104到 1： 105稀釋物作為模板進(jìn)行下一輪 PCR。 ? 另外對(duì)上一輪 PCR產(chǎn)物稀釋也降低了下一輪PCR產(chǎn)物出錯(cuò)的概率。 很少或沒有檢測到產(chǎn)物的原因 ? 如果已經(jīng)調(diào)整了 Mg2＋ 濃度、緩沖液的 pH值和循環(huán)產(chǎn)物，而且也增加了循環(huán)數(shù)，嘗試過了較低的退化溫度和 TD PCR，但在 EB染色的凝膠上還是看不到產(chǎn)物（聚丙烯酰胺凝膠比瓊脂糖凝膠要敏感一些），而陽性對(duì)照表明試劑沒有問題，下一步該怎么辦？ 延長起始的變性時(shí)間和（或）提高溫度能增加模板 DNA完全變性的可能，以提供最大數(shù)量的引物配對(duì)位點(diǎn)。這一可選步驟的標(biāo)準(zhǔn)條件是 95?C變性 5分鐘， 有可能擴(kuò)增發(fā)生了，只是效率不高，如果這樣，可通過對(duì)干凝膠或印跡的雜交來檢測產(chǎn)物。 用同一套引物或者最好用嵌套式引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增 ，有可能得到特異產(chǎn)物，這時(shí)必須用第一次 PCR產(chǎn)物的從 1： 100到 1： 10000的一系列 10倍稀釋物。 ? 很少或沒有產(chǎn)物可能提示 DNA樣品中存在抑制物。 許多 PCR的抑制物已被描述過，它們包括離子性去污劑（如 SDS）、酚、肝素等。通過把原 PCR混合物與已知陽性對(duì)照模板（被證明可以擴(kuò)增）的稀釋物混合的方法可以驗(yàn)證制備的模板中是否有抑制物。若有，重新抽提、乙醇沉淀和（或）離心超濾有可能解決問題。純化模板過程中殘留的蛋白酶 K可能會(huì)降解Taq DNA聚合酶，但它在 95 ?C保溫 5分鐘很容易變性。
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