引物設(shè)計(jì)11條黃金法則-資料下載頁(yè)
2025-06-30 01:42本頁(yè)面
【正文】 物可能是最好的。產(chǎn)物應(yīng)具有好的特異性和高的產(chǎn)生效率，并含有能用于探針捕捉雜交實(shí)驗(yàn)的足夠信息。這一長(zhǎng)度范圍的產(chǎn)物可以通過(guò)采用兩步擴(kuò)增循環(huán)方法得到，從而減少擴(kuò)增時(shí)間。其他PCR方法有不同的最佳產(chǎn)物長(zhǎng)度。例如，通過(guò)定量的RNAPCR檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)，產(chǎn)物應(yīng)該足夠大以便構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)性模板，這樣，產(chǎn)物和競(jìng)爭(zhēng)物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來(lái)。這些產(chǎn)物一般在250～750bp范圍內(nèi)。⑦補(bǔ)充說(shuō)明若在cDNA序列內(nèi)找尋PCR引物，需特別注意兩點(diǎn)：首先，盡力將引物和產(chǎn)物保持在mRNA的編碼區(qū)域內(nèi)，因?yàn)檫@是生成蛋白質(zhì)的獨(dú)特序列，不像3’末端非編碼區(qū)域與許多其他mRNA有同源性；第二，盡力把引物放在不同的外顯子上，以便使RNA特異的PCR產(chǎn)物與從污染DNA中產(chǎn)生的產(chǎn)物在大小上相區(qū)別。若PCR的目的是克隆一個(gè)基因或cDNA的特異序列，產(chǎn)物的大小是根據(jù)具體應(yīng)用預(yù)選的。在這里，計(jì)算機(jī)程序可以提供關(guān)于期望區(qū)域側(cè)翼選擇引物對(duì)的信息。在選擇用來(lái)擴(kuò)增來(lái)自不同物種DNA的引物時(shí)，應(yīng)避開(kāi)mRNA的5’和3’末端非翻譯區(qū)序列，因?yàn)樗鼈兛赡軟](méi)有任何的同源性。3．簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)①設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物時(shí)，一定要檢查靶擴(kuò)增區(qū)域選定氨基酸遺傳密碼的簡(jiǎn)并度。很顯然，我們期望選擇簡(jiǎn)并度最低的氨基酸，達(dá)到提高特異性的目的。②充分注意物種對(duì)于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡(jiǎn)并性。③應(yīng)努力避免3’末端的簡(jiǎn)并，對(duì)于大多數(shù)氨基酸殘基來(lái)說(shuō)，意味著引物3’末端不要位于密碼子的第三位。④在一些多義位置使用脫氧次黃嘌呤（dI）代替簡(jiǎn)并堿基。4．測(cè)序引物設(shè)計(jì)當(dāng)然，測(cè)序引物的設(shè)計(jì)一般都由測(cè)序公司來(lái)完成，如果需要自己設(shè)計(jì)的話(huà)；那么除了按照上面所提到的引物設(shè)計(jì)通用標(biāo)準(zhǔn)外，還需要注意兩點(diǎn)：①測(cè)序引物的特異性的標(biāo)準(zhǔn)掌握應(yīng)該更嚴(yán)格一些，也就是說(shuō)設(shè)計(jì)時(shí)更優(yōu)先考慮特異性。因?yàn)樵跍y(cè)序反應(yīng)中，如果引物與模板在非預(yù)期位置退火并引發(fā)鏈延伸，會(huì)對(duì)結(jié)果對(duì)來(lái)很大的干擾甚至造成結(jié)果無(wú)法識(shí)讀。②測(cè)序引物的Tm值適當(dāng)高一些?，F(xiàn)在大部分測(cè)序反應(yīng)均選用耐熱的測(cè)序級(jí)DNA聚合酶來(lái)催化，并采用PCR的熱循環(huán)程序。選用的測(cè)序引物的Tm值稍高一些，有助于使反應(yīng)順利跨過(guò)待測(cè)模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)，也有助于降低非特異反應(yīng)。5．探針的設(shè)計(jì)探針的設(shè)計(jì)，根據(jù)不同的用途各有其設(shè)計(jì)特點(diǎn)，這里只是就通用的原則進(jìn)行討論：①探針的長(zhǎng)短一般在2050核苷酸之間，過(guò)長(zhǎng)合成成本高，且易出現(xiàn)聚合酶合成錯(cuò)誤，雜交時(shí)間長(zhǎng)。太短則特異性下降。②注意G和C的含量努力控制在4060％，同時(shí)一種堿基連續(xù)重復(fù)不超過(guò)4個(gè)，以免非特異性雜交產(chǎn)生。③探針自身序列不能形成二聚體，也不能有“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)存在，這一點(diǎn)上的要求就要比普通引物設(shè)計(jì)嚴(yán)格得多。④如果探針地靶目標(biāo)是多個(gè)基因的混合物，就必須控制該探針與無(wú)關(guān)基因之間的相似性在70%以下。
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