引物設計11條黃金法則-文庫吧資料
2025-07-06 01:42本頁面
【正文】 響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。引物設計時使合成的寡核苷酸鏈（18～24聚物）適用于多種實驗條件仍不失為明智之舉。總的來說，最好在特異性允許的范圍內(nèi)尋求安全性。引物越長，擴增退火時被引發(fā)的模板越少。①引物長度；特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。特異性是指發(fā)生錯誤引發(fā)的頻率。需要指出的是，引物不必與模板完全同源，因此可包含啟動子序列、限制酶識別位點或5’端的各種修飾，這種對引物的修飾不會妨礙PCR反應，而會在以后使用擴增子時發(fā)揮作用。通過對成千種組合的檢測，調(diào)整各項參數(shù)，可提出適合用戶特殊實驗的引物。一些影響PCR反應中引物作用的因素諸如溶解溫度、引物間可能的同源性等，易于在計算機軟件中被編碼和限定。當然，即使有了好的引物，依然需要進行反應條件的優(yōu)化，比如調(diào)整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。好的引物設計可以避免背景和非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，甚至在RNAPCR中也能識別cDNA或基因組模板。1．簡介寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個擴增反應成功的關(guān)鍵。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備尋找合適的引物非常不容易。至于設計軟件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都應該可以的。7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C.5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。引物設計的要求：1)避免重復堿基，尤其是G.2)Tm=5860度。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。附：值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。若不能避開這一區(qū)域時，用7deaza2′脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。實驗表明，待擴區(qū)域自由能（△G176。某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的5′端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。引物3′端的△G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應。△G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。否則易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復性。尤其3′端不應
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