酶工程實(shí)驗(yàn)生物工程-資料下載頁
2025-01-06 15:53本頁面
【正文】 終止酶促反應(yīng)，加水楊酸試劑1ml，沸水浴精確反應(yīng) 5 min,冷卻后定容至25 mL，然后測定 A540的吸光值。記錄每個(gè)水浴的準(zhǔn)確溫度。 （ 3） 酶催化的各管 A540 值均進(jìn)行酸催化的校正。畫出酶催化的反應(yīng)速度對(duì)溫度的關(guān)系曲線。 比色管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 蔗糖溶液 mL 1 1 1 1 1 1 1 醋酸 buffer mL 1 1 1 1 1 1 1 無水乙醇 mL 0 2 ddH2O mL 2 0 乙醇終濃度 0 % 5% 10% 20% 40% 50% 酶 mL 0 1 1 1 1 1 1 37℃ 準(zhǔn)確反應(yīng) 10 min， 1 mL 1 mol/L NaOH終止酶促反應(yīng) 水楊酸試劑mL 1 1 1 1 1 1 1 沸水浴精確反應(yīng) 5 min,冷卻后定容至 25 mL A540 （ Km）的測定 比色管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 蔗糖溶液 0 2 ddH2O 2 0 醋酸 buffer 1 1 1 1 1 1 1 游離酶 1 1 1 1 1 1 1 37℃ 準(zhǔn)確反應(yīng) 10 min， 1 mL 1 mol/L NaOH終止酶促反應(yīng) 水楊酸試劑 1 1 1 1 1 1 1 沸水浴精確反應(yīng) 5 min,冷卻后定容至 20 mL A540 三、結(jié)果分析 1. 畫出蔗糖酶活性與 pH的關(guān)系曲線。 。 。 Km值。 實(shí)驗(yàn)四 蔗糖酶的固定化 一、實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)用殼聚糖固定化酵母蔗糖酶屬共價(jià)偶聯(lián)法。 為了評(píng)價(jià)固定化方法的好壞，需進(jìn)行酶回收率和酶相對(duì)活力的計(jì)算。 實(shí)驗(yàn)步驟 （ 1）稱取 3 g殼聚糖溶于 98 mL蒸餾水中，攪拌均勻，再滴加 2 mL冰醋酸，攪拌至均勻的粘稠狀； （ 2）稱取 8 g NaOH置大燒杯中，加入 180 mL蒸餾水及 20 mL甲醇。 （ 3）將拔出推塞的注射器架在鐵架臺(tái)上，倒入粘稠狀的殼聚糖溶液，使殼聚糖溶液從 20 cm高的注射器出口滴入大燒杯中，以制備殼聚糖微球載體。 （ 4）殼聚糖溶液滴加完畢后，靜止片刻，待微球完全沉入燒杯底部時(shí)，反復(fù)水洗多次至 pH值中性 ，瀝干水分。加入 1%戊二醛溶液 100 mL，靜置 2 h，使戊二醛偶聯(lián)于殼聚糖載體上。 （ 1）將靜置 2 h后的殼聚糖微球載體中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸餾水洗滌 5次，以除去多余的戊二醛。 （ 2）將實(shí)驗(yàn)一純化得到的酵母蔗糖酶酶液 1 mL用蒸餾水稀釋至 100 mL,與偶聯(lián)戊二醛的殼聚糖載體混合，靜置偶聯(lián)過夜。 分別測游離酶、固定化酶以及殘留酶液的酶活力。 比色管號(hào) 1 2 3 4 蔗糖溶液 1ml 1ml 1ml 1ml 醋酸 buffer 1ml 1ml 1ml 1ml 游離酶 /固定化酶 0 1ml游離酶 1g固定化酶 1ml殘留酶液 37℃ 準(zhǔn)確反應(yīng) 10 min， 1 mL 1 mol/L NaOH終止酶促反應(yīng) 水楊酸試劑 1ml 1ml 1ml 1ml 沸水浴精確反應(yīng) 5 min,冷卻后定容至 20 mL A540 三 . 結(jié)果分析 酶活回收率 = ————————————— 固定化酶活力 游離酶總活力 100% 酶的相對(duì)活力 = ————————————————————— 固定化酶活力 游離酶活力 殘留酶液活力 100% 實(shí)驗(yàn)五 蔗糖酶的化學(xué)修飾 一、實(shí)驗(yàn)原理 N溴代琥珀酰亞胺（ NBS）能特異地修飾蛋白質(zhì)分子中色氨酸殘基的吲哚基團(tuán)。 若色氨酸殘基是酶活性中心的必需基團(tuán)，那么經(jīng) NBS修飾后，酶活性喪失的程度與修飾劑的濃度有化學(xué)計(jì)量關(guān)系。 在底物存在的情況下，修飾劑 NBS不影響酶的活力。 P NH + N Br O O P NH N O OH + HBr 吲哚基團(tuán) N溴代琥珀酰亞胺 羥吲哚衍生物 氧化 二、實(shí)驗(yàn)步驟 比色管號(hào) 空白組 1 2 3 4 5 6 8 蔗糖酶液（ ul） 100 100 100 100 100 100 醋酸 buffer（ ul） 200 20 40 60 80 100 1mmol/l的 NBS（ ul） 100 80 60 40 20 NBS終濃度 mmol/l 0 1 0 37攝氏度水浴修飾 20min 蔗糖溶液 /ul 100 100 100 100 100 100 100 37攝氏度準(zhǔn)確反應(yīng) 20min， 100ul1mol/LNaOH終止酶促反應(yīng) DNS試劑 ul 100 100 100 100 100 100 100 沸水浴精確反應(yīng) 5min，冷卻后加入 A540 相對(duì)活力 %（以 6號(hào)管酶活力為 100%） 取 8只試管，編號(hào)，按下表操作： 三、結(jié)果分析 以 NBS濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)活力為縱坐標(biāo)繪制折線圖，并分析不同濃度的NBS對(duì)酵母蔗糖酶活力的影響，得出結(jié)論 。
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