植物病原細菌學實驗-資料下載頁
2025-01-06 05:28本頁面
【正文】 rophoresis of full length PCR product from Y160 M: DNA marker。 1: Y 2:positive control。 3 4: CK 引物量： 每條引物的濃度 ～ 1umol或 10～ 100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。 酶及其濃度： 目前有兩種 Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR反應約需酶量 (指總反應體積為 100ul時 )，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。 4 PCR反應操作注意事項： dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和 PCR擴增效率有密切關系， dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。 dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以 1M NaOH或 1M Tris。HCL的緩沖液將其 PH調節(jié)到 ～ ，小量分裝， 20℃ 冰凍保存。多次凍融會使 dNTP降解。在 PCR反應中， dNTP應為 50～ 200umol/L，尤其是注意 4種 dNTP的濃度要相等 ( 等摩爾配制 )，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時 (偏高或偏低 )，就會引起錯配。濃度過低又會降低 PCR產物的產量。dNTP能與 Mg2+結合，使游離的 Mg2+濃度降低。 模板 (靶基因 )核酸 模板核酸的量與純化程度，是 PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一。 Mg2+濃度 Mg2+對 PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的 PCR反應中，各種 dNTP濃度為 200umol/L時，Mg2+濃度為 ～ 。 Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。 PCR反應條件的選擇 PCR反應條件為 溫度、時間和循環(huán)次數 。 溫度與時間的設置： 基于 PCR原理三步驟而設置變性 退火 延伸三個溫度點。 ①變性溫度與時間： 變性溫度低，解鏈不完全是導致 PCR失敗的最主要原因。一般情況下， 93℃ ～ 94℃ lmin足以使模板 DNA變性，若低于 93℃ 則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致 PCR失敗。 ②退火 (復性 )溫度與時間： 重要因素。 變性后溫度快速冷卻至 40℃ ～ 60℃ ，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板 DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。 ③延伸溫度與時間： PCR反應的延伸溫度一般選擇在 70～ 75℃ 之間，常用溫度為 72℃ ，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。 PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般 1Kb以內的 DNA片段，延伸時間 1min是足夠 的。 3～4kb的靶序列需 3～ 4min；擴增 10Kb需延伸至 15min。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。 循環(huán)次數 循環(huán)次數決定 PCR擴增程度。 PCR循環(huán)次數主要取決于模板 DNA的濃度。一般的循環(huán)次數選在 30～ 40次之間，循環(huán)次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。 5 PCR污染與對策 PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污 染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生 . 1）污染原因 ? 標本間交叉污染 ? PCR試劑的污染 ? PCR擴增產物污染 . ? 實驗室中克隆質粒的污染 2）污染的監(jiān)測 ?對照試驗 ?陽性對照 ?陰性對照 ?重復性試驗 ?選擇不同區(qū)域的引物進行 PCR擴增 3）防止污染的方法 ?合理分隔實驗室 ?樣槍 ?預混和分裝 PCR試劑 ?防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用 . ?設立適當的陽性對照和陰性對照 ?減少 PCR循環(huán)次數 ?選擇質量好的 Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前 應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部 .開管動作要輕，以防管內液體濺出 . PCR反應 ： A. 取 的 eppendorf 管中依次加入效率試劑（共50?l） : 35?l H20 5?l 10X PCR反應緩沖液 4?l 25 mmol/L MgCl2 4?l 4種 dNTP ?l 上游引物（引物 1） ?l 下游引物（引物 2） ?l 模板 DNA(約 1ng) Taq DNA聚合酶（約 ） 混勻后離心 5秒鐘 二、實驗內容和操作方法 B．混合物在 94℃ 下加熱 5min 。 C． 94 ℃ 變性 30秒種， 62℃ 退火 1分鐘， 72℃ 延伸 2分 鐘，循環(huán) 30輪，進行 PCR。最后一輪循環(huán)結束后，于 72℃ 下保溫 10分鐘，使反應產物擴增充分。 電泳： 取 10 ul擴增產物用 1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，檢查反應產物及長度 。 三、作業(yè) 1 簡述 PCR反應基本原理及其操作注意事項
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