植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)-wenkub
2023-01-21 05:28:13 本頁(yè)面
【正文】 000 ｍ L。 ：碳素化合物產(chǎn)酸試驗(yàn) 單糖 （ 葡萄糖 、 半乳糖 ） ；雙糖 （ 麥芽糖 、 乳糖 ） ；多糖 （ 淀粉 ） ；醇 （ 甘露醇 ） 。分別在培養(yǎng) 4和 7 d后觀察記錄。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和操作方法 （ 1） 配方：牛肉膏 3ｇ ， 蛋白胨 10ｇ ， NaCl 5ｇ ， 瓊脂 20ｇ ， 蒸餾水 1000 ｍ L。 (NA)：分離和培養(yǎng)最常用 （ 2） 配制過程：將牛肉膏 、 蛋白胨 、 NaCl 溶于蒸餾水后 ， 調(diào)節(jié) ， 加入瓊脂溶化后分裝于三角瓶和試管 。 好氧性細(xì)菌，只在開管的上部生長(zhǎng)；兼性厭氧性細(xì)菌，則在開管的上下部都能生長(zhǎng)；厭氧性細(xì)菌，則只能在開管的下部和閉管中生長(zhǎng)。 有的細(xì)菌不產(chǎn)酸和氣 ， 有的只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣 ， 少數(shù)植物病原細(xì)菌既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣 （ 3） 分裝：將上述培養(yǎng)基分裝于試管中 ， 每管 10 mL左右 。 （ 2） 配制過程：將蛋白胨 、 葡萄糖 、 磷酸氫二鉀溶于蒸餾水 ， 調(diào)節(jié) ， 每管分裝5mL即可 。 7. 吲哚試驗(yàn) （ 1） 配方： 蛋白胨 ， 磷酸氫二鈉 ，葡萄糖 ， 蒸餾水 1000ｍ L。 9. 淀粉水解試驗(yàn) （ 1） 配方： 牛肉浸膏 g， 蛋白胨 ， 淀粉 g， 瓊脂 1520 g， 蒸餾水 1000 ｍ L。 普通培養(yǎng)基為 121℃ 20~30min， 以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。 ?滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生 物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類。 高壓蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是基于水的沸點(diǎn)隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計(jì)的。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。 升壓、保壓和降壓 當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開始上升。一般是把待滅菌的物品包裝就緒后，放入電烘箱中烘烤，即加熱至 160～ 170℃ 維持 1～ 2h。 三、作業(yè) 實(shí)驗(yàn)二 植物病原細(xì)菌的分離 和致病性測(cè)定 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和操作方法 （ 1） 首先要選擇典型 、 新鮮病組織 。 （ 二 ） 植物病原細(xì)菌的分離 1. 細(xì)菌懸浮液的配制 （ 不同癥狀類型分離材料的選擇和表面消毒 ） ：將切取的組織塊在 70％ 乙醇中浸一下立即取出 ， 然后用表面消毒劑進(jìn)行表面消毒 ， 可以采用 ％ 升汞 ， 15″－ 2min或 ％的次亞氯酸鹽如漂白粉 （ 1： 9稀釋液 ） 2min 3次 ， 將病組織放在另一個(gè)培養(yǎng)皿的滅菌水中 ， 剪破中心或以滅菌玻璃棒研碎病組織靜置 20－ 30分鐘 ， 等細(xì)菌游出 。 由于細(xì)菌位于表皮細(xì)胞和木質(zhì)部之間 ， 因此應(yīng)用酒精棉花擦拭表面 ， 在火焰上表面消毒 ，再在滅菌皿中實(shí)行解剖后以滅菌玻棒將其搗碎 ，靜置浸泡 24h。 （ 1）平板劃線分離法：被普遍采用 ，在已凝固的平板培養(yǎng)基表面劃線 如果菌液濃度大，培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動(dòng)角度減小，增加劃線的次數(shù) 劃 4條線后，將接種環(huán)滅菌，培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動(dòng) 90176。 1. 配制 107108CFU/mL的細(xì)菌懸浮液 ， 菌齡 48小時(shí)左右； （二）致病性測(cè)定 2. 指示植物的選擇：一般用煙草 ， 在假單胞和黃單胞菌屬上較適用 。 5. 結(jié)果觀察：在 24～ 48h表現(xiàn)枯斑為陽(yáng)性反應(yīng) ，3d左右出現(xiàn)黃斑為陰性反應(yīng) 。 將 碘和碘化鉀在研缽中研和 ， 慢慢加水并繼續(xù)研和直至碘和碘化鉀溶解 ， 然后加水稀釋到 300mL， 盛入棕色試劑瓶 ， 放暗處備用 。 E. 用 95%酒精褪色約 30秒 。 使用前用蒸餾水稀釋 2倍 ， 染色時(shí)過濾 ， 濾液直接滴在涂片上 。 用吸管沿試管壁緩緩加入無(wú)菌水 5mL， 靜置 30分鐘左右 ， 配成菌懸液 。 鑒定中有何作用 ？ 為什么 ？ ， 在操作過程中也要注意動(dòng)作的輕柔 ， 為什么 ？ 3 觀察和記錄 NA平板上的細(xì)菌菌落性狀 、 菌體形狀 、 運(yùn)動(dòng)性和革蘭氏染色結(jié)果 。 1%碳素化合物 。 （ 2 ） 配 制 過 程 ： 將 NH4H2PO4 、 氯化鉀 、 ， 調(diào)節(jié) 加入溴百里酚蘭 ， 最后加入碳素化合物 （ 也可分別滅菌后加入 ） 3） MR試驗(yàn)結(jié)果觀察：取上述培養(yǎng)液 5ml， 加甲基紅試劑 2~3滴 ， 呈明顯紅色為陽(yáng)性 ， 呈黃色為陰性 。 在 4h內(nèi)出現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性反應(yīng) 。 3） 結(jié)果觀察：紙條變黑表示有硫化氫產(chǎn)生 ， 為陽(yáng)性反應(yīng) 。 1） 接菌：采用穿刺法接菌后 ， 放在適溫中培養(yǎng) 13周 。 2） 結(jié)果觀察： ：產(chǎn)酸達(dá)到 ， 如產(chǎn)氣凝塊斷裂； 凝乳酶的作用而凝固 ， 凝塊收縮與乳清分離 。培養(yǎng)基凝固后，用接種針蘸細(xì)菌懸浮液針刺接種，一直刺到管底。 （五）其他生理生化試驗(yàn) 2） 測(cè)定方法： A. Kovacs：在培養(yǎng)皿內(nèi)放一張濾紙 ， 濾紙上加 34滴試劑使其濕潤(rùn) ， 用牙簽挑取 24h菌苔涂在濾紙上 ， 60秒內(nèi)變成紫色為陽(yáng)性反應(yīng) ， 60秒后或不便色為陰性 。 實(shí)驗(yàn)五 植物病原細(xì)菌的 PCR分子鑒定 1 了解 PCR反應(yīng)的原理； 2 掌握 PCR反應(yīng)的操作方法。 2 The procedure of PCR 5’ 5’ 3’ 3’ Taq Primers ponent denaturation (94℃) extension 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Taq Taq repeated anneal (72℃) (50℃) 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’
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