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正文內(nèi)容

植物病原細(xì)菌學(xué)實驗(參考版)

2025-01-09 05:28本頁面
  

【正文】 電泳: 取 10 ul擴(kuò)增產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析,檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長度 。 C. 94 ℃ 變性 30秒種, 62℃ 退火 1分鐘, 72℃ 延伸 2分 鐘,循環(huán) 30輪,進(jìn)行 PCR。一般的循環(huán)次數(shù)選在 30~ 40次之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定 PCR擴(kuò)增程度。延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。 PCR延伸反應(yīng)的時間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,一般 1Kb以內(nèi)的 DNA片段,延伸時間 1min是足夠 的。退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。 變性后溫度快速冷卻至 40℃ ~ 60℃ ,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會導(dǎo)致 PCR失敗。 ①變性溫度與時間: 變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致 PCR失敗的最主要原因。 PCR反應(yīng)條件的選擇 PCR反應(yīng)條件為 溫度、時間和循環(huán)次數(shù) 。 Mg2+濃度 Mg2+對 PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的 PCR反應(yīng)中,各種 dNTP濃度為 200umol/L時,Mg2+濃度為 ~ 。dNTP能與 Mg2+結(jié)合,使游離的 Mg2+濃度降低。在 PCR反應(yīng)中, dNTP應(yīng)為 50~ 200umol/L,尤其是注意 4種 dNTP的濃度要相等 ( 等摩爾配制 ),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時 (偏高或偏低 ),就會引起錯配。HCL的緩沖液將其 PH調(diào)節(jié)到 ~ ,小量分裝, 20℃ 冰凍保存。 4 PCR反應(yīng)操作注意事項: dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和 PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系, dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。 酶及其濃度: 目前有兩種 Taq DNA聚合酶供應(yīng), 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。 2:positive control。 2 The procedure of PCR 5’ 5’ 3’ 3’ Taq Primers ponent denaturation (94℃) extension 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Taq Taq repeated anneal (72℃) (50℃) 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 2 cycles 4 copies 3 cycles 8 copies 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 10 反應(yīng)緩沖液 ( 含 Mg2+ ) ?l dNTP混合物 , 10 mmol/L ?l 上游引物 , 20 ?mol/L ?l 下游引物 , 20 ?mol/L ?l 模板 DNA ?l Taq plus DNA聚合酶 , 5 U/?l ?l 加雙蒸水至終體積為 50 ?l 3 反應(yīng)體系 取一 ml PCR薄壁管,依次加入以下試劑: M 1 2 3 4 3kb 2kb % agrose gel electrophoresis of full length PCR product from Y160 M: DNA marker。 PCR由 變性 退火 延伸 三個反應(yīng)步驟構(gòu)成: ① 模板 DNA的變性 :模板 DNA經(jīng)加熱至 94℃ 左右一定時間后,使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA解離,使之成為單鏈(以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備); ② 模板 DNA與引物的退火 (復(fù)性 ):模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至 55℃ 左右,引物與模板 DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合; ③ 引物的延伸 : DNA模板 引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下,以 dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板 DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,重復(fù)循環(huán) 變性 退火 延伸 三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 實驗五 植物病原細(xì)菌的 PCR分子鑒定 1 了解 PCR反應(yīng)的原理; 2 掌握 PCR反應(yīng)的操作方法。 ( 接觸酶 ) 試驗 3) 結(jié)果觀察: 在半分鐘內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生的為陽性 ,不產(chǎn)生氣泡的為陰性 。 (五)其他生理生化試驗 2) 測定方法: A. Kovacs:在培養(yǎng)皿內(nèi)放一張濾紙 , 濾紙上加 34滴試劑使其濕潤 , 用牙簽挑取 24h菌苔涂在濾紙上 , 60秒內(nèi)變成紫色為陽性反應(yīng) , 60秒后或不便色為陰性 。 好氧性細(xì)菌,只在開管的上部生長;兼性厭氧性細(xì)菌,則在開管的上下部都能生長;厭氧性細(xì)菌,則只能在開管的下部和閉管中生長。培養(yǎng)基凝固后,用接種針蘸細(xì)菌懸浮液針刺接種,一直刺到管底。 1) 接菌:將細(xì)菌接種于淀粉瓊脂平板上 , 適溫下培養(yǎng) 2448小時 。 2) 結(jié)果觀察: :產(chǎn)酸達(dá)到 , 如產(chǎn)氣凝塊斷裂; 凝乳酶的作用而凝固 , 凝塊收縮與乳清分離 。 (三)大分子化合物的利用 2) 結(jié)果觀察 : 將經(jīng)過培養(yǎng)的接菌試
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