植物病原細菌學(xué)實驗(參考版)
2025-01-09 05:28本頁面
【正文】 電泳： 取 10 ul擴增產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長度 。 C． 94 ℃ 變性 30秒種， 62℃ 退火 1分鐘， 72℃ 延伸 2分 鐘，循環(huán) 30輪，進行 PCR。一般的循環(huán)次數(shù)選在 30～ 40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定 PCR擴增程度。延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。 PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般 1Kb以內(nèi)的 DNA片段，延伸時間 1min是足夠 的。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。 變性后溫度快速冷卻至 40℃ ～ 60℃ ，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致 PCR失敗。 ①變性溫度與時間： 變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致 PCR失敗的最主要原因。 PCR反應(yīng)條件的選擇 PCR反應(yīng)條件為 溫度、時間和循環(huán)次數(shù) 。 Mg2+濃度 Mg2+對 PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的 PCR反應(yīng)中，各種 dNTP濃度為 200umol/L時，Mg2+濃度為 ～ 。dNTP能與 Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度降低。在 PCR反應(yīng)中， dNTP應(yīng)為 50～ 200umol/L，尤其是注意 4種 dNTP的濃度要相等 ( 等摩爾配制 )，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時 (偏高或偏低 )，就會引起錯配。HCL的緩沖液將其 PH調(diào)節(jié)到 ～ ，小量分裝， 20℃ 冰凍保存。 4 PCR反應(yīng)操作注意事項： dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和 PCR擴增效率有密切關(guān)系， dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學(xué)活性。 酶及其濃度： 目前有兩種 Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。 2:positive control。 2 The procedure of PCR 5’ 5’ 3’ 3’ Taq Primers ponent denaturation (94℃) extension 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Taq Taq repeated anneal (72℃) (50℃) 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 2 cycles 4 copies 3 cycles 8 copies 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 10 反應(yīng)緩沖液 （ 含 Mg2＋ ） ?l dNTP混合物 ， 10 mmol/L ?l 上游引物 ， 20 ?mol/L ?l 下游引物 ， 20 ?mol/L ?l 模板 DNA ?l Taq plus DNA聚合酶 ， 5 U/?l ?l 加雙蒸水至終體積為 50 ?l 3 反應(yīng)體系 取一 ml PCR薄壁管，依次加入以下試劑： M 1 2 3 4 3kb 2kb % agrose gel electrophoresis of full length PCR product from Y160 M: DNA marker。 PCR由 變性 退火 延伸 三個反應(yīng)步驟構(gòu)成： ① 模板 DNA的變性 ：模板 DNA經(jīng)加熱至 94℃ 左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈（以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備）； ② 模板 DNA與引物的退火 (復(fù)性 )：模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃ 左右，引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合； ③ 引物的延伸 ： DNA模板 引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán) 變性 退火 延伸 三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 實驗五 植物病原細菌的 PCR分子鑒定 1 了解 PCR反應(yīng)的原理； 2 掌握 PCR反應(yīng)的操作方法。 （ 接觸酶 ） 試驗 3） 結(jié)果觀察： 在半分鐘內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生的為陽性 ，不產(chǎn)生氣泡的為陰性 。 （五）其他生理生化試驗 2） 測定方法： A. Kovacs：在培養(yǎng)皿內(nèi)放一張濾紙 ， 濾紙上加 34滴試劑使其濕潤 ， 用牙簽挑取 24h菌苔涂在濾紙上 ， 60秒內(nèi)變成紫色為陽性反應(yīng) ， 60秒后或不便色為陰性 。 好氧性細菌，只在開管的上部生長；兼性厭氧性細菌，則在開管的上下部都能生長；厭氧性細菌，則只能在開管的下部和閉管中生長。培養(yǎng)基凝固后，用接種針蘸細菌懸浮液針刺接種，一直刺到管底。 1） 接菌：將細菌接種于淀粉瓊脂平板上 ， 適溫下培養(yǎng) 2448小時 。 2） 結(jié)果觀察： ：產(chǎn)酸達到 ， 如產(chǎn)氣凝塊斷裂； 凝乳酶的作用而凝固 ， 凝塊收縮與乳清分離 。 （三）大分子化合物的利用 2） 結(jié)果觀察 ： 將經(jīng)過培養(yǎng)的接菌試
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