酶聯(lián)免疫分析技術(shù)ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-01-05 20:20本頁(yè)面
【正文】 表達(dá)表面抗原，即 S旦白，任何影 響 S旦白表達(dá)水平或抗原性的突變，都 可能導(dǎo)致表面抗原檢測(cè) 出陰性結(jié)果。 ：血清脂質(zhì)過(guò)高、膽紅素、血紅蛋 白及血液黏度過(guò)大等，均對(duì) ELISA結(jié)果有干擾作用。 外源性干擾因素 ：由于各種人為因素引起的標(biāo)本溶血，均可因紅細(xì)胞破壞時(shí)釋放 大量過(guò)氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過(guò)氧化酶為標(biāo)記的 ELISA測(cè)定 方法中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，而干擾測(cè)定結(jié)果。 ：因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化酶，因此，被細(xì)菌 污染的標(biāo)本同溶血標(biāo)本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色，而干擾測(cè)定結(jié)果。 血清標(biāo)本如是以無(wú)菌操作分離，則可以在 2～ 8℃ 下保存一周，如為有菌 操作，則建議冰凍保存。樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)在－ 70℃ 以下 ：在冰箱中保存過(guò)久的標(biāo)本，血清 IgG可聚合成多聚體，在 間接法 ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深，甚至造成假陽(yáng)性；標(biāo)本放置時(shí)間過(guò) 長(zhǎng)，有時(shí)抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾， ELISA標(biāo)本宜為新鮮采集，如不能測(cè)定， 5天內(nèi)測(cè)定的可放 40C冰箱， 1 周后測(cè)定的應(yīng)放低溫保存，凍存后溶解的標(biāo)本，蛋白局部濃縮，分布不均， 應(yīng)充分混均后再測(cè)定，但混均時(shí)應(yīng)輕柔，不可劇烈振蕩。 2022813 11 外源性干擾因素 ，如收集管中無(wú)促凝劑和抗凝劑 ，則血液通常 在半小時(shí)后開始凝固， 18~24h 完全凝固 。日常檢驗(yàn)中，常 在血液還未開始凝固時(shí)即離心分離血清，此時(shí)因血液沒(méi)有 完全凝固，離出的 “ 血清 ” 并非為完全的血清，其中仍殘 留 部 分 纖 維 蛋 白 原 ， 如 將 其 加 入 微 孔 中 ， 在 ELISA 測(cè) 定 過(guò) 程中仍可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié) 果。 5. 標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響：抗凝劑（如肝素 EDTA ）、酶抑 制劑（如 NaN3 可可抑制辣根過(guò)氧化酶活 性）及快速離心膠 等均可對(duì)測(cè)定產(chǎn)生一定的干擾作用。 影響 ELISA試劑盒質(zhì)量的因素 ? ? ? ? ? ? 固相材料 :聚苯乙烯塑料 抗原 :純化、合成和基因工程抗原 抗體：多抗、單抗和基因工程抗體 酶結(jié)合物：酶免疫測(cè)定的核心成份 色原底物： OPD和 TMB 運(yùn)輸貯存 影響 ELISA測(cè)定的因素 ?實(shí)驗(yàn)操作 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn) ? ? ? ? ? ? 優(yōu)質(zhì)的試劑 良好的儀器 熟練的操作人員 嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)環(huán)境 標(biāo)本的狀態(tài) 嚴(yán)格遵照規(guī)定操作 ELISA常出現(xiàn)的問(wèn)題 ？ ? 溫育的時(shí)間、濕度不夠 ? 顯色反應(yīng)的時(shí)間不夠 ? 所配制緩沖液有問(wèn)題 ? 加樣槍是否準(zhǔn)確和校正 ? 質(zhì)控品是否合格 ? 試劑的靈敏度是否 達(dá)標(biāo) ? 操作人員是否存在操作問(wèn) 題 ELISA常出現(xiàn)的問(wèn)題 ？ ? 加樣本和試劑的量不準(zhǔn)，加樣過(guò)快，孔間發(fā)生污染。 ? 加錯(cuò)標(biāo)本或標(biāo)本加在孔壁上部非包被區(qū)。 ? 不同批號(hào)試劑組合混用。 ? 反應(yīng)時(shí)間不同，溫育不均衡。 ? 孔內(nèi)有污染。板的包被不均勻。 ? 標(biāo)本未 完全 凝固 ， 加入 易出現(xiàn) 纖維 蛋白 凝塊或 殘留的 血細(xì)胞，易出現(xiàn)加陽(yáng)性。 ? 洗板機(jī)堵塞。 ? 酶標(biāo)儀濾光片及光源不足等。 儀器設(shè)備 質(zhì)控方法 頻 度 失控標(biāo)準(zhǔn) 酶 標(biāo) 儀 及 全 自 動(dòng) 酶 免 分 析系統(tǒng) 預(yù)防性維護(hù) 及校準(zhǔn) 每年 1 次 不符合要求 水浴箱 溫度檢測(cè) 每次實(shí)驗(yàn) 不符合要求 加 樣 器 及 全 自 動(dòng) 加 樣 設(shè) 備 校準(zhǔn) 每年 1 次 不符合要求 2022813 12 ELISA常出現(xiàn)的問(wèn)題 （陽(yáng)性對(duì)照不顯色） ? 漏加酶結(jié)合物， ? 洗液出 現(xiàn)問(wèn) 題 （含 有酶 抑制物 或錯(cuò) 把終 止液當(dāng) 濃縮洗 液 ） ， 加 顯 色 液 時(shí) 只 加 A 液 /B 液 ， 把 終 止 液 當(dāng) 成 顯 色 液，使用加終止液的容器加顯色液。 ？ ? ? ? ? 洗板機(jī)管路不通。 顯色液變質(zhì)（配制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)）， 底物受酶污染，洗液受酶污染， 錯(cuò)用了抗原 /抗體的酶容器 。 測(cè)定前的質(zhì)量控制 ? 實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理 ? 理想的試劑和操作方法 ? 人員培訓(xùn) 環(huán)境監(jiān)控記錄 檢測(cè)中外部影響因素 ＊ 溫度 ＊濕度 ＊通風(fēng) ＊噪音 儀器設(shè)備的正確使用 ? ? 加樣器 全自動(dòng)加樣系統(tǒng)的“拖帶現(xiàn)象” ? 酶標(biāo)儀：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、雙波長(zhǎng)比色？ ? 洗板機(jī) 儀器設(shè)備的校準(zhǔn)周期 人員培訓(xùn) ? 免疫測(cè)定通常為手工操作，要得到可靠的測(cè)定結(jié)果， 操作人員需要一定技術(shù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。在實(shí)際工作中， ? 不同的操作者所獲得的結(jié)果往往變化較大，因此， 人員的培訓(xùn)非常重要。 知其然知其所以然 。 質(zhì)控品 試劑 則 2022813 監(jiān)測(cè)質(zhì)量保證 儀器 標(biāo)準(zhǔn)化操作程序 作業(yè)指導(dǎo)書 13
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