免疫標記技術ppt課件-資料下載頁
2025-10-25 17:36本頁面
【正文】 AB呈色 免疫印跡 ? 免疫印跡中需要注意的問題 ? 抗體性質(zhì) ? 樣品中待測蛋白質(zhì)的含量 ? 背景問題 ? 轉(zhuǎn)印效率低 ? 設置對照與結(jié)果解釋 ? 免疫印跡技術的靈敏度 ? 抗體的性質(zhì) ? 影響免疫印跡成敗的一個主要因素是抗原分子中表位的性質(zhì)。只有能識別耐變性表位的抗體可與抗原結(jié)合。多數(shù)多克隆抗血清中含有這種類型的抗體，所以常用于免疫印跡實驗中。許多單克隆抗體不能與變性抗原反應，因為它識別的表位是抗原蛋白正確折疊所形成的三維空間構(gòu)象。 ? 樣品中待檢測蛋白質(zhì)的含量 ? 影響免疫印跡實驗的因素之一是蛋白質(zhì)原液中抗原的濃度。目前可檢出抗原的最低濃度是 。含量極低的蛋白在進行電泳之前需用免疫沉淀等方法純化，這樣能夠擴大免疫印跡檢測范圍。免疫印跡不需要高親和力抗體 ，因為轉(zhuǎn)印膜上局部高濃度的抗原提供了較多與抗體結(jié)合的機會，大大提高了相互作用的親和力。 ? 背景問題 ? 背景高和非特異性條帶可能是由于抗體制劑中存在與印跡膜上其他蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體（非特異性抗體）。免疫印跡理想的抗體應是僅能特異性識別待測抗原，但實際情況是印跡膜上總會出現(xiàn)一些額外條帶。其來源一般有兩種：一種是由于制劑中存在的非特異性抗體產(chǎn)生的背景條帶，另一種則是由于特異性抗體與含有與待測抗原類似表位的多肽發(fā)生的交叉反應。 ? 動物的抗血清中含有各種各樣的抗體，包括采集血清時存在于動物體內(nèi)的全部抗體。其中有針對各種細胞成分的自身抗體及針對侵入動物體內(nèi)的微生物產(chǎn)生的抗體，這些抗體既有新近產(chǎn)生的，也有在采血之前產(chǎn)生的，還有在免疫動物時污染的其他抗原刺激產(chǎn)生的抗體。這些抗體可與印跡膜上的同類抗原或密切相關的抗原結(jié)合產(chǎn)生額外的條帶，致使特異性條帶變得模糊不清。由于這種類型的污染是特異的，不可能用降低非特異性背景的一般方法來解決。 ? 轉(zhuǎn)印效率低 ? 轉(zhuǎn)印中常遇到轉(zhuǎn)印效率低的問題。為了使轉(zhuǎn)印有效進行，必須在電極和濾紙／凝膠／轉(zhuǎn)印膜／濾紙夾層組合之間保持良好的電流通路并保證整個電極表面電流分布均勻。這要求電極必須保持潔凈且不粘附任何非導電物質(zhì)。 ? 另外，兩電極之間的任何直接連接，在濾紙／凝膠／轉(zhuǎn)印膜／濾紙夾層組合內(nèi)存在的氣泡也會在局部阻止轉(zhuǎn)印過程。 ? 另一個常見問題是大分子量蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印較困難。此時可降低分離膠的濃度。如果研究的是多個不同大小的多肽，一個濃度的膠不能滿足要求時，可考慮用不同濃度的丙烯酰胺配制兩種分離膠。 ? 設置對照與解釋結(jié)果 ? 免疫印跡從細胞裂解液開始就需設置兩組對照，包括含有已知抗原的陽性對照樣品和能與陰性對照抗體發(fā)生反應的細胞裂解物。 ? 陽性對照是含有已知或標準量的待測抗原樣品，來源于細菌或桿狀病毒超常表達系統(tǒng)或已鑒定的細胞系。它可提示免疫印跡是否成功，并能精確比較抗原的相對分子量；如果陽性對照中抗原量已知，可粗略估計出待測樣品中抗原的含量。 ? 陰性對照給出的是非免疫抗體與待測樣品的背景讀數(shù)。若有可能，再設置一個不含待測抗原的細胞裂解液對照（例如來源于含無效基因的細胞）更利于解釋結(jié)果。 ? 免疫印跡技術的靈敏度 ? 運用化學發(fā)光檢測系統(tǒng) ,可檢測到最低濃度 ，分子量為 50000KD 的蛋白質(zhì)，高于此濃度的樣品更易檢出。電泳時樣品上樣量影響條帶形狀，如果上樣量過大條帶會發(fā)生扭曲變形。 ? 另外還有幾種方法可用于提高免疫印跡的靈敏度： ? 在電泳前應用免疫沉淀法純化和濃縮抗原。該法除可濃縮濃度極低的抗原，還可在電泳和免疫印跡前將其與無關蛋白質(zhì)分離，使對極低濃度抗原的研究成為可能。 ? 其他提高靈敏度的方法都是為增強檢測信號強度而設計，包括使條帶局部酶的活性增強或使用信號更好和更強的熒光試劑等。
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