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抗體標(biāo)記ppt課件-資料下載頁

2025-04-29 02:46本頁面
  

【正文】 00層析柱,分管收集,將 A280 nm的第一峰收集, 20 ℃ 凍存 ? 改良過碘酸鈉法:過碘酸鈉將 HRP表面的糖分子氧化為活潑的醛基,可與蛋白質(zhì)上的氨基形成希夫堿,后者可用 NaBO4(或乙醇胺 )還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記物 1)將 5mgHRP溶于 1ml蒸餾水中 2)加入 ,室溫避光攪拌 20min 3) 1mM( )醋酸鈉緩沖液透析, 4℃ 過夜 4)加 20μl, ( )碳酸鹽緩沖液,使以上醛化的 HRP的 pH升高至 9~ ,然后立即加入 10mg抗體,避光室溫攪拌 2h 5)加入 4mg/ml NaBO4溶液,混勻,4℃ , 2h 6) ( ) PBS透析, 4℃ 過夜 膠體金標(biāo)記抗體 ?是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物,應(yīng)用于抗原 抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù) ?膠體金是由氯金酸在還原劑的作用下,聚合成特定大小的金顆粒,并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài) ? 結(jié)合力與溶液 pH和蛋白質(zhì)等電點有關(guān) ? pH等于或稍偏于蛋白質(zhì)等電點時,蛋白質(zhì)呈電中性,此時蛋白質(zhì)分子于膠體金顆粒相互間的靜電作用較小,但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻最大,處于一種微弱的水化狀態(tài),輕易吸附于金顆粒表明 ? 在低于蛋白質(zhì)的等電點時,蛋白質(zhì)帶正電荷,膠體金帶負(fù)電荷,兩者極易靜電結(jié)合形成大的聚合物 ? pH高于蛋白質(zhì)等電點時,蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,與金顆粒的負(fù)電荷相互排斥而不能互相結(jié)合 ? 透析除鹽: 除去蛋白質(zhì)中多余的電解質(zhì) ? 去除蛋白質(zhì)中的沉淀: 離心 ? 標(biāo)記: 用 K2CO3或 HCl調(diào)節(jié)金溶液至所需 pH 加入最佳標(biāo)記量的蛋白質(zhì)溶液,電磁攪拌 2~ 3min 加入 1% PEG20220至終濃度 % 10000~ 100000g離心 30~ 60min,吸取上清 將沉淀懸浮于含 ~ ,離心沉淀后,再用同一緩沖液恢復(fù),加入疊氮鈉, 4℃ 保存 用 Sephadex G200柱進行純化,用 % BSA洗脫 生物素標(biāo)記技術(shù) ?原理:生物素的琥珀酰亞胺同抗體的自由氨基反應(yīng) ?特點:不影響標(biāo)記抗體的生物活性 結(jié)合快速,具有高度特異性和穩(wěn)定性
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