抗體標(biāo)記ppt課件-資料下載頁
2025-04-29 02:46本頁面
【正文】 00層析柱，分管收集，將 A280 nm的第一峰收集， 20 ℃ 凍存 ? 改良過碘酸鈉法：過碘酸鈉將 HRP表面的糖分子氧化為活潑的醛基，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成希夫堿，后者可用 NaBO4(或乙醇胺 )還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記物 1）將 5mgHRP溶于 1ml蒸餾水中 2）加入 ，室溫避光攪拌 20min 3） 1mM（ ）醋酸鈉緩沖液透析， 4℃ 過夜 4）加 20μl， （ ）碳酸鹽緩沖液，使以上醛化的 HRP的 pH升高至 9～ ，然后立即加入 10mg抗體，避光室溫攪拌 2h 5）加入 4mg/ml NaBO4溶液，混勻，4℃ ， 2h 6） （ ） PBS透析， 4℃ 過夜 膠體金標(biāo)記抗體 ?是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原 抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù) ?膠體金是由氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài) ? 結(jié)合力與溶液 pH和蛋白質(zhì)等電點有關(guān) ? pH等于或稍偏于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)呈電中性，此時蛋白質(zhì)分子于膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻最大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，輕易吸附于金顆粒表明 ? 在低于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)帶正電荷，膠體金帶負(fù)電荷，兩者極易靜電結(jié)合形成大的聚合物 ? pH高于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，與金顆粒的負(fù)電荷相互排斥而不能互相結(jié)合 ? 透析除鹽： 除去蛋白質(zhì)中多余的電解質(zhì) ? 去除蛋白質(zhì)中的沉淀： 離心 ? 標(biāo)記： 用 K2CO3或 HCl調(diào)節(jié)金溶液至所需 pH 加入最佳標(biāo)記量的蛋白質(zhì)溶液，電磁攪拌 2～ 3min 加入 1％ PEG20220至終濃度 ％ 10000～ 100000g離心 30～ 60min,吸取上清 將沉淀懸浮于含 ～ ，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復(fù)，加入疊氮鈉， 4℃ 保存 用 Sephadex G200柱進行純化，用 ％ BSA洗脫 生物素標(biāo)記技術(shù) ?原理：生物素的琥珀酰亞胺同抗體的自由氨基反應(yīng) ?特點：不影響標(biāo)記抗體的生物活性 結(jié)合快速，具有高度特異性和穩(wěn)定性
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