【正文】 ion)或慢離子：甘氨酸根 mcl?clmp?pmG?G(Cl代表氯根 ， P代表蛋白質(zhì) ， G代表甘氨酸根 )有效遷移率 =m?， m為遷移率 ， ?為解離度 ) ? 當(dāng)進(jìn)入 ， 甘氨酸解離度增加 ， 其有效遷移率超過蛋白質(zhì)； （ c)電位梯度的不連續(xù)性； (2)分子篩效應(yīng) (3)電荷效應(yīng) 72 2022/5/26 72 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE） ? 聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí) ， 蛋白質(zhì)的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素 。 ? 如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉 (sodium dodecyl sulfate,簡稱 SDS)， 則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量 ， 而與所帶電荷和形狀無關(guān) 。 因此可以利用 SDSPAGE測定蛋白質(zhì)分子量 。 ? 這個(gè)技術(shù)首先是 1967年由 shapiro建立 ， 1969年由 Weber和Osborn完善 73 2022/5/26 73 在樣品和凝膠中加入還原劑和 SDS ? 巰基乙醇是強(qiáng)還原劑可使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂，使蛋白質(zhì)分子被解聚成多肽亞單位； ? SDS是陰離子去污劑，可使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，引起構(gòu)象改變。 ? SDS十二烷基硫酸根帶有大量負(fù)電荷，大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和 SDS結(jié)合，消除或掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有電荷的差別，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用蛋白質(zhì)分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開。 ? 可根據(jù)已知分子量蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率和分子量的對(duì)數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用未知蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率求得分子量。 74 2022/5/26 74 75 2022/5/26 75 應(yīng)用 ? SDSPAGE常用來測定蛋白質(zhì)的分子量； ? 蛋白質(zhì)的純化制備，即電泳后將蛋白質(zhì)從凝膠中回收。 76 2022/5/26 76 表 31 分離純化方法的比較 方 法 原 理 優(yōu) 點(diǎn) 缺 點(diǎn) 應(yīng) 用 離心分離法 離心力和物質(zhì)沉降系數(shù)的差別 操作簡單 分辨率低 蛋白質(zhì)分離 鹽析法 鹽析作用 操作簡單，成本低， 重復(fù)性較好 分辨率低，純化 倍數(shù)低 蛋白質(zhì)的分級(jí)沉 淀 有機(jī)溶劑沉淀法 脫水作用和降低介電常數(shù) 操作簡單，分辨力較強(qiáng) 對(duì)蛋白質(zhì)有變性作用，成本較高 蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖的分級(jí)沉淀 凝膠層析法 分子篩的排 阻作用 分辨力強(qiáng)，不引起 蛋白質(zhì)變性 成本高 分子質(zhì)量有差別的可溶性物質(zhì) 離子交換法 離子基團(tuán)的 交換作用 分辨力強(qiáng)，分離量 大 費(fèi)時(shí)間，酸堿用 量大 可電離的生化物 質(zhì) 親和層析法 分離物與配體間的親和作用 分辨力很強(qiáng) 一種配體只分離一類物質(zhì)，局限性大 生命大分子物質(zhì) 電 泳 物質(zhì)的帶電 性質(zhì) 設(shè)備簡單、操作方 便、分辨率高 成本高 生物分子的分離、 定性、定量 77 2022/5/26 77 SDSPAGE試劑與器材 試劑： 10%SDS、 凝膠貯液（ 30％ %Bis)、分離膠緩沖液（ mol/L － HCl 緩沖液）、 濃縮膠緩沖液（ mol/L －HCl 緩沖液）、 5*SDS加樣緩沖液、 10%過硫酸銨、 10%TEMED、 、％考馬斯亮蘭 R250染液、脫色液 器材：垂直板電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 、脫色搖床 78 2022/5/26 78 SDSPAGE操作 方法 夾心式垂直板電泳槽 (1)裝上貯槽和固定螺絲銷釘 ， 仰放在桌面上 。 (2)將長 、 短玻璃板分別插到凵形硅橡框的凹形槽中 ，注意勿用手接觸灌膠面的玻璃 。 (3)將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上 ， 短玻璃板應(yīng)面對(duì)上貯槽 。 (4)將下貯槽的銷孔對(duì)準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽 ，雙手以對(duì)角線的方式旋緊螺絲帽 。 (5)豎直電泳槽 ， 在長玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)加入已融化的 1%瓊脂 (糖 )。 其目的是封住空隙 ， 凝固后的瓊脂 (糖 )中應(yīng)避免有氣泡 。 79 2022/5/26 79 ? 2 配膠表 SDS – 不連續(xù)體系凝膠的制備配制 20 mL 不同濃度的分離膠 配制 10 mL 濃縮試劑名稱 所需試劑用量 / mL 所需試劑用量 / mL% 1 0% 15% 3%凝膠貯液 5 .00 分離膠緩沖液( T ris HC l ) 2 .50 —濃縮膠緩沖液( T ris HC l ) — — — 10%TEMED 10 ％ SDS 重蒸水 1 混勻后，置真空干燥器中，抽氣 10 min10% 過硫酸銨 0. 10 80 2022/5/26 80 3. 制備凝膠 將混合后的分離膠溶液，用細(xì)長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約 1 cm。用 1 mL注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水 (約 3–4 mm)，用于隔絕空氣，使膠面平整。 約 3060 min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。 將上、下貯槽的蒸餾水倒去 ，將混合均勻后的濃縮膠溶液，用細(xì)長頭的滴管加到長、短玻璃板的窄縫內(nèi) (即分離膠上方 )，距短玻璃上緣 cm處，輕輕加入樣品槽模板 .在上、下貯槽中加入蒸餾水，但不能超過短玻璃板上緣。靜置電泳槽， 10 min左右，上膠即可聚合，再放置 1020 min，加入電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約 cm，輕輕取出樣品槽模板，即可加樣。 81 2022/5/26 81 4. 樣品的處理及加樣 將樣品按 –1 mg/mL加樣品溶解液，溶解后，將其轉(zhuǎn)移到帶塞的小離心管中，輕輕蓋上蓋子 (不要塞緊，以免加熱時(shí)迸出 )，在 100℃ 沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。 用微量進(jìn)樣器取 25 ?l上述混合液，通過緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。 82 2022/5/26 82 5 .電泳 將電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接，接通冷卻水，打開電泳儀開關(guān)，開始時(shí)電流為 10 mA，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)至 2030 mA，當(dāng)溴酚藍(lán)染料距硅膠框 1 cm時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源及冷卻水。 6 .染色與脫色 電泳結(jié)束后 ， 取下凝膠模 ， 卸下硅膠框 ， 用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開短玻璃板 ， 從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記 ， 在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心 ， 插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記 。 加入染色液染色 12 h， 再用脫色液脫色 ，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰 ， 即可計(jì)算相對(duì)遷移率 。 83 2022/5/26 83 7. 結(jié)果處理 量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離 (cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離 (cm)， 按下式計(jì)算相對(duì)遷移率 mR: 相對(duì)遷移率 mR= 蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離 (cm) 溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離 (cm) 84 2022/5/26 84 六 、 注意事項(xiàng) （ 1） 安裝電泳槽時(shí)要注意均勻用力旋緊固定螺絲 ， 避免緩沖液滲漏 。 （ 2） 用瓊脂 (糖 )封底及灌膠時(shí)不能有氣泡 ， 以免電泳時(shí)影響電流的通過 。 （ 3）樣品中應(yīng)含一定濃度的蔗糖溶液，目的是用以防止樣品因?qū)α鞫幌♂尅? （ 4）加樣時(shí)樣品不能超出凹形樣品槽。加樣槽中不能有氣泡，如有氣泡，可用注射器針頭挑除。