核酸的結(jié)構(gòu)ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-01-05 07:01本頁(yè)面
【正文】 60增高的現(xiàn)象 。 核酸的紫外吸收 由于核酸中堿基的共軛雙鍵，所以對(duì)紫外光有強(qiáng)烈吸收，最大吸收峰在 260nm附近，利用這一特性可進(jìn)行核酸的定量測(cè)定及純度分析。 紫外吸收法中 DNA或 RNA的定量 A260= : ?50μg/ml雙鏈 DNA ?40μg/ml單鏈 DNA（或 RNA） ?20μg/ml寡核苷酸 ? A260/A280 – DNA純品 : A260/A280 = – RNA純品 : A260/A280 = DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂及堿基堆積力的破壞 DNA的降解 ? 在溫度、 pH急劇變化，或在酶、超聲波、高速攪拌、電離輻射的作用下， DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，同時(shí)維系 DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵也被切斷， DNA分子量發(fā)生變化的過(guò)程。 理化性質(zhì) : 紫外吸收 ↓ 粘度 ↑ 高于 Tm值 5℃ 退火 緩 慢冷 卻（ annealing） 迅 速冷 卻生物活性得到部分恢復(fù) DNA在一定條件下可以復(fù)性 淬火 DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué) DNA 復(fù)性過(guò)程基本上符合 二級(jí)反應(yīng) 動(dòng)力學(xué)，其中 第一步為慢反應(yīng) ，因?yàn)閮蓷l鏈必須依靠隨機(jī)碰撞找到一段堿基配對(duì)的部分，首先形成雙螺旋。 第二步為快反應(yīng) ，尚未配對(duì)的其他部分堿基配對(duì)相結(jié)合，象拉鎖鏈一樣迅速形成雙螺旋。 DSS k? ????復(fù)性反應(yīng)： S： single strand DNA D： double strand DNA 完全變性 DNA的復(fù)性反應(yīng)可表示為： 2kcdtdc??經(jīng)重排，積分得： c c0 1+kc0t = 1 c0： t=0時(shí)，起始 DNA的濃度（ mol/L） c： t時(shí)間時(shí)，單鏈 DNA的濃度（ mol/L） k：復(fù)性反應(yīng)常數(shù)（ L/molsec） t：復(fù)性時(shí)間（ sec） ?DNA復(fù)性反應(yīng)的初始濃度 co 與反應(yīng)完成一半所需時(shí)間的乘積為常數(shù)。在一定條件下，復(fù)性反應(yīng)的速度可以用 cot1/2 來(lái)衡量。 ?實(shí)驗(yàn)證明 K值與復(fù)性 DNA分子量成正比。 cot1/2 或 K稱 DNA分子復(fù)雜度 (plexity)， DNA片段越大復(fù)性越慢。 ?DNA的濃度越大復(fù)性越快。 k DNA變性的影響 ?任何有機(jī)固體物質(zhì)都有一個(gè)特定的熔點(diǎn) ?DNA分子內(nèi)部也是一個(gè)十分規(guī)則有序的結(jié)構(gòu) ——有特定熔點(diǎn)（ Tm）。 ?與有機(jī)固體熔解過(guò)程相似，在緩慢將 DNA溶液加熱過(guò)程中，開(kāi)始并不出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，直到某一狹窄溫度范圍，發(fā)生螺旋到線團(tuán)轉(zhuǎn)變。 ——DNA熔解。 DNA的熔解溫度（ melting temprature Tm） DNA在加熱變性時(shí)，紫外吸收增加值達(dá)總增加值一半時(shí)（雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)？）的溫度稱為該 DNA的 變性溫度 ，也稱 熔點(diǎn) 或 熔解溫度 ，用 Tm 表示。 DNA的 Tm值一般在 82—95 度之間，每種 DNA都有一個(gè)特征性的 Tm值。 解鏈曲線 如果在連續(xù)加熱 DNA的過(guò)程中以溫度對(duì) A260值作圖 ， 所得的曲線稱為解鏈曲線 。 影響 Tm值的因素 ? DNA的均一性： 均質(zhì) DNA Tm值范圍較窄，異質(zhì) DNA Tm值的范圍較寬 ? DNA中 GC對(duì)的含量 經(jīng)驗(yàn)式 : (G+C)%=() ? 鹽離子強(qiáng)度： 離子強(qiáng)度低的介質(zhì)中， Tm 值較低范圍較寬；離子強(qiáng)度較高的介質(zhì)中，Tm 值較高，范圍較窄。（ DNA在含鹽緩沖液中保存） GC含量對(duì) Tm值的影響 肺炎球菌 粘質(zhì)沙雷菌 鹽濃度對(duì) Tm值的影響 4. pH對(duì) DNA變性的影響 ?介質(zhì)中 pH的改變可導(dǎo)致 DNA變性 ?25℃ ， ，從中性到 右，約發(fā)生 10%的 DNA可逆變性。 ?pH3以下、 pH12以上為不可逆變性。 ?通常介質(zhì)中 pH在 ， DNA Tm值變化不大。 pH ~ 12 酮基 → 烯醇基 pH ~ 23 NH2 → NH 2+ (質(zhì)子化 ) 改變氫鍵的形成與結(jié)合力 極端 pH條件的影響 一切減弱氫鍵、堿基堆積力的因素 均將使 Tm 值降低 堿基因 pH不同采取同分異構(gòu)形式 酮式 烯醇式 鳥(niǎo)嘌呤 內(nèi)酰胺 雙內(nèi)酰亞胺 尿嘧啶 DNA雙鏈中堿基間在氨基氫和羰基氧之間形成氫鍵 5. 堿基組成對(duì) DNA變性的影響 ?中性 pH條件下， GC對(duì)增加， DNA熱穩(wěn)定性增加。 ?，G+C含量每增加 ， DNA Tm值增加℃ 。 ?DNA熱穩(wěn)定性還與堿基的排布有關(guān)，多個(gè) G或 C 連續(xù)排列 ——抗熱核心。 增色效應(yīng)的跳躍現(xiàn)象 ( Jump of Hyperchromicity ) 高分子量的 DNA分子在熱變性過(guò)程中 , 富含AT區(qū)域首先發(fā)生 變性 , 然后逐步擴(kuò)展 , 表現(xiàn)增色效應(yīng)的跳躍現(xiàn)象。變性加快。 rich AT rich AT 6. 離子強(qiáng)度對(duì) DNA變性的影響 單鏈 DNA主鏈的磷酸基團(tuán) 負(fù)電荷的靜電斥力 兩條單鏈 DNA的分離 Na+在磷酸基團(tuán)周圍形成的電子云 對(duì)靜電斥力產(chǎn)生屏蔽作用 減弱靜電斥力 7. 有機(jī)溶劑對(duì) DNA變性的影響 ?許多有機(jī)溶劑可導(dǎo)致 DNA變性 ?酰胺、脲、氨基甲酸酯、醇類等促使 DNA變性，與 DNA中 GC含量、介質(zhì)離子強(qiáng)度、變性劑濃度、DNA濃度有關(guān)。 有機(jī)溶劑變性機(jī)制 ?有機(jī)溶劑存在，離子溶劑化能力低，難于中和DNA分子負(fù)電荷； ?有機(jī)溶劑具疏水性，穩(wěn)定因變性暴露的疏水基團(tuán)； ?尿素，酰胺與堿基間形成氫鍵 → 改變堿基對(duì)間的氫鍵， Tm 值可降至 40℃ 左右 DNA變性的影響 ?紫外線、 X射線、熒光染料 → DNA分子化學(xué)損傷→ 局部變性 → Tm值降低。 ?羥基胺破壞 DNA分子中胞嘧啶殘基，降低 Tm。 ?二胺、多胺、精胺與 DNA磷酸基團(tuán)相互作用，中和負(fù)電荷 ——DNA穩(wěn)定。 紫外線和一些化學(xué)因子、烷化劑對(duì) DNA的損傷 亞硝酸 烷化劑：乙基甲烷磺酸（ EMS） 紫外線誘導(dǎo)胸腺嘧啶二聚體 與嵌合劑的反應(yīng) 溴乙啶 丫啶橙 放線菌素 D
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