分子遺傳學(xué)8章基因操作技術(shù)及其應(yīng)用-資料下載頁
2025-05-12 15:03本頁面
【正文】 cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色體 DNA 限制酶部分消化 外源 DNA與載體 DNA混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體 感染大腸桿菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫 cDNA文庫 (cDNA library) 以某種細(xì)胞的全部 mRNA為模板 ， 利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與 mRNA互補(bǔ)的 DNA（ cDNA） 再?gòu)?fù)制成雙鏈 cDNA,與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化入受體菌 ， 得到含全部表達(dá)基因的種群 ， 稱為 C文庫 (cDNA library)。 C文庫具有組織細(xì)胞特異性 。 組織或細(xì)胞 RNA提取 反轉(zhuǎn)錄 cDNA(double strand) 克隆載體 重組 DNA分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 受體菌 cDNA文庫構(gòu)建流程圖 cDNA library construction （二）、 分子雜交技術(shù) 分子雜交（ molecular hybridization） ： 標(biāo)記的探針 DNA變性后與變性后的靶 DNA/RNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，形成雜種分子的過程。 分子雜交包括： DNADNA雜交（ Southern blot） 。 DNARNA雜交（ Northern blot） 。 蛋白 蛋白雜交（ Western blot）。 基因探針（ gene probe） 基因探針 （ probe） ：是指與一段目的基因或 DNA/RNA片段特異雜交的核苷酸序列 。 可以是整個(gè)基因 ， 或是基因的一部分 ， 是 DNA， 也可以是 RNA。 1）、探針標(biāo)記 同位素： 32P , 35S , 3HdNTP等； 非同位素：地高辛 dNTP ，生物素 dNTP。 2）探針制備方法 缺口平移法（ Nick translation） 隨機(jī)引物法（ Random primer） 末端標(biāo)記法（ Random primer） Nick Translation OH p OH+ P P DNA dNTP ， DNA酶 I，DNA聚合酶 I 32PdNTP BiodNTP 隨機(jī)引物標(biāo)記探針 5` 3` 5` 5` 3` DNA 32pdNTP,BioDntp 6bp primer Klenow,dNTP 變性 復(fù)姓 DNA末端標(biāo)記 Southern blot 原理和步驟 提取 T 、 Cell DNA 限制酶消化 DNA片段 電泳分離 變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜 變性、雜交 洗膜、放射自顯影、結(jié)果分析 Southern blot + 探針 Southern blot Northern blot 原理和步驟 提取 T 、 Cell 總 RNA 提純分離 mRNA 凝膠電泳分離 RNA 變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜 雜交 洗膜、放射自顯影、結(jié)果分析 Western blot 原理和步驟 提取 T 、 Cell 蛋白 聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白 變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜 抗體雜交 Western blot
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