分子遺傳學(xué)8章基因操作技術(shù)及其應(yīng)用(已修改)
2025-05-28 15:03 本頁(yè)面
【正文】 第八章 基因操作技術(shù)及其應(yīng)用 一、重組 DNA技術(shù) 二 、 PCR技術(shù) 三、基因文庫(kù)及分子雜交技術(shù) ??? 克隆 (clone)無(wú)性繁殖 ??? 分子克隆 –DNA的無(wú)性繁殖技術(shù) ??? 重組 DNA技術(shù)的重大突破帶動(dòng)了現(xiàn)代生物技術(shù)的興起，并很快產(chǎn)生了許多生命科學(xué)的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)二、重組DNA技術(shù)是基因工程的核心技術(shù) 一、重組 DNA技術(shù) 重組 DNA技術(shù)，又稱(chēng)為基因克隆或分子克隆技術(shù)。它是基因工程的核心技術(shù)。 應(yīng)用酶學(xué)的方法 ， 在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì) （ 同源的或異源的 、 原核的或真核的 、 天然的或人工的 DNA） 與載體 DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的 DNA分子 —— 復(fù)制子(replicon)， 繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞 ， 篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞 ， 再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一 DNA分子 ， 也稱(chēng)基因克隆或重組 DNA (rebinant DNA)。 DNA克隆定義 （ 1）獲得目的基因； （ 2）與克隆載體連接，形成新的重組 DNA分子； （ 3）用重組 DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳； （ 4）對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定； （ 5）對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。 重組 DNA操作一般步驟 ： （ 1） 直接從生物體中提取總 DNA， 構(gòu)建基因組 DNA文庫(kù) ，從中釣取目的基因 。 （ 2） 以 mRNA為模板 ， 反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的 DNA片段 ， 建立全長(zhǎng) cDNA文庫(kù)或 EST文庫(kù)；從文庫(kù)直接篩選所需基因 。 （ 3） 根據(jù)同源克隆等原理克隆需要的目的基因片段 。 （ 4） 直接化學(xué)合成 。 (一 )、獲得目的基因的方法： (二 )、限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用則是 DNA重組的關(guān)鍵 限制性?xún)?nèi)切核酸酶 (restrictive endonucleases)，又稱(chēng)限制酶。是識(shí)別并特異性地切割雙鏈 DNA序列的一種核酸內(nèi)切酶。 （ “ 分子手術(shù)刀 ” ） 發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi)，現(xiàn)已分離出 100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組 DNA技術(shù)和基因診斷中重要的一類(lèi)工具酶。 限制酶（“基因剪刀”） 根據(jù)其來(lái)源命名。如： 屬名 菌株名 E co R I 種名 編號(hào) EcoRI來(lái)源于大腸桿菌 RY13菌株 ,I指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。 命名 每種限制酶能識(shí)別和切割的通常 4~8個(gè)核苷酸序列，稱(chēng)為限制性位點(diǎn)（ restriction sites）或切點(diǎn)。（回文結(jié)構(gòu)） 如： Hare III 5’GGCC 3’ 3’CCGG 5’ Bam HI 5’GGATCC3` 3’CCTAGG5’ 平末端 (blunt end) 對(duì)稱(chēng)軸切，連接效果差 切割形式 粘性末端（ sticky end）交錯(cuò)切 切割形式 ? 不論 DNA的來(lái)源如何，同一種限制酶切割后產(chǎn)生的粘性末端容易重新連接。因此可將不同種屬的 DNA重組。如人和質(zhì)粒 DNA等。
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1