分子遺傳學(xué)8章基因操作技術(shù)及其應(yīng)用-wenkub.com
2025-05-08 15:03 本頁面
【正文】 可以是整個(gè)基因 ， 或是基因的一部分 ， 是 DNA， 也可以是 RNA。 分子雜交包括： DNADNA雜交（ Southern blot） 。 缺點(diǎn)：（ 1）需靶 DNA序列的信息； （ 2）產(chǎn)物短小， DNA復(fù)制不精確。 體外程序化的 DNA合成技術(shù) 。 轉(zhuǎn)染 （ infection） ：是特殊形式的轉(zhuǎn)化 ， 是離體狀態(tài)的完整的病毒噬菌體 DNA/RNA感染受體菌而引起的后者遺傳型和表型發(fā)生的變化 。C 重組體 4. 人工接頭 (linker)連接 由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 3180。 3180。 3180。 3180。 3180。 3180。C 重組體 配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。 大片段外源 DNA插入后 ，在體外包裝進(jìn)而被克隆 。 可包裝 37~52kb DNA分子 ?？煽寺?5kb的 cDNA。 能自主復(fù)制；且插入外源 DNA后，不影響其復(fù)制能力； 具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定； 有克隆位點(diǎn)（外源 DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)； 分子量小，以容納較大的外源 DNA； 具生物安全性。 根據(jù)上述限制酶的特點(diǎn)，在基因工程和基因診斷中的重要用途： ? 載體（ Vector） :將外源目的 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。如人和質(zhì)粒 DNA等。如： 屬名 菌株名 E co R I 種名 編號 EcoRI來源于大腸桿菌 RY13菌株 ,I指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。是識別并特異性地切割雙鏈 DNA序列的一種核酸內(nèi)切酶。 （ 2） 以 mRNA為模板 ， 反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的 DNA片段 ， 建立全長 cDNA文庫或 EST文庫；從文庫直接篩選所需基因 。它是基因工程的核心技術(shù)。 應(yīng)用酶學(xué)的方法 ， 在體外將各種來源的遺傳物質(zhì) （ 同源的或異源的 、 原核的或真核的 、 天然的或人工的 DNA） 與載體 DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的 DNA分子 —— 復(fù)制子(replicon)， 繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞 ， 篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞 ， 再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一 DNA分子 ， 也稱基因克隆或重組 DNA (rebinant DNA)。 （ 3） 根據(jù)同源克隆等原理克隆需要的目的基因片段 。 （ “ 分子手術(shù)刀 ” ） 發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi)，現(xiàn)已分離出 100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。 命名 每種限制酶能識別和切割的通常 4~8個(gè)核苷酸序列，稱為限制性位點(diǎn)（ restriction sites）或切點(diǎn)。 ? 用于人類基因組的 DNA分析，具特定的酶切位點(diǎn)。 （三）、基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體及其選擇 常用載體： 質(zhì)粒、噬菌體、 粘粒、大片段克隆載體（ BAC，YAC等）。 載體的選擇標(biāo)準(zhǔn) 1. 質(zhì)粒 (plasmid) 2. λ 噬菌體 (λphage) ? 置換 λ載體 – 溶解途徑 載體和外源 DNA整合到宿主菌 DNA中。 是一種可在體外包裝的細(xì)菌病毒 ,可高效感染大腸桿菌 。 改建后的 λ噬菌體發(fā)展了多種較大型的克隆載體，如 ： (cosmid ve
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