分子遺傳學8章基因操作技術及其應用-文庫吧
2025-04-22 15:03 本頁面
【正文】 ? 用于人類基因組的 DNA分析，具特定的酶切位點。 ? Gene突變改變酶切位點的消失或新產(chǎn)生將改變酶切片段長度。應用于限制性片段多態(tài)性分析。 根據(jù)上述限制酶的特點，在基因工程和基因診斷中的重要用途： ? 載體（ Vector） :將外源目的 DNA導入受體細胞，并能自我復制和增殖的工具。 （三）、基因轉(zhuǎn)運載體及其選擇 常用載體： 質(zhì)粒、噬菌體、 粘粒、大片段克隆載體（ BAC，YAC等）。 克隆載體 (cloning vector) 為使插入的外源 DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體 。 表達載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體 。 能自主復制；且插入外源 DNA后，不影響其復制能力； 具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定； 有克隆位點（外源 DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點； 分子量小，以容納較大的外源 DNA； 具生物安全性。 載體的選擇標準 1. 質(zhì)粒 (plasmid) 2. λ 噬菌體 (λphage) ? 置換 λ載體 – 溶解途徑 載體和外源 DNA整合到宿主菌 DNA中?？煽寺?23kb的外源 DNA。 ? 插入載體 – 裂解途徑 DNA在宿主細胞中復制，然后包裝成噬菌體，裂解宿主，釋放噬菌體?？煽寺?5kb的 cDNA。 是一種可在體外包裝的細菌病毒 ,可高效感染大腸桿菌 。 λ噬菌體 DNA是線狀雙鏈 DNA分子 ， 全長約 50kb， 每條鏈各帶 12bp長的單鏈互補末端 粘末端 (COS序列 )。 進入宿主細胞后不久 ， COS序列堿基配對環(huán)化 。 可包裝 37~52kb DNA分子 。 改建后的 λ噬菌體發(fā)展了多種較大型的克隆載體，如 ： (cosmid vector)： 粘粒 是將質(zhì)粒和 λ噬菌體改建的一種載體 .它含 COS序列 ,插入一小plasmid –而得名 Cosmid。 改建后的粘粒含有 λ噬菌體的復制起點和cos末端 ， 全長 8kb。 可感染大腸桿菌 。 大片段外源 DNA插入后 ，在體外包裝進而被克隆 。 可包裝 30~50 kb長的 DNA片段 ， 多用于基因文庫構建 。 4. 其他載體：大片段 DNA克隆載體 細菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 約 300kb 噬菌體 PI人工染色體 （ PI artificial chromosome, PAC） 約 100kb 酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 200kb — 2021kb 動物病毒 DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒） （四）、外源 DNA片斷和載體的連接 1. 粘性末端連接 方式： (1)同一限制酶切位點連接 (2)不同限制酶切位點連接 配伍末端連接 非配伍末端連接 Bam HⅠ 切割反應 GGATCC CCTAGG T4 DNA連接酶 15186。C GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ 切割 GC C T A GGC C T A GGA TC CGGA TC CG載體 DNA用 Bam HⅠ 切割 GC C
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