分子遺傳學(xué)8章基因操作技術(shù)及其應(yīng)用-文庫吧
2025-04-22 15:03 本頁面
【正文】 ? 用于人類基因組的 DNA分析，具特定的酶切位點(diǎn)。 ? Gene突變改變酶切位點(diǎn)的消失或新產(chǎn)生將改變酶切片段長度。應(yīng)用于限制性片段多態(tài)性分析。 根據(jù)上述限制酶的特點(diǎn)，在基因工程和基因診斷中的重要用途： ? 載體（ Vector） :將外源目的 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。 （三）、基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體及其選擇 常用載體： 質(zhì)粒、噬菌體、 粘粒、大片段克隆載體（ BAC，YAC等）。 克隆載體 (cloning vector) 為使插入的外源 DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體 。 表達(dá)載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體 。 能自主復(fù)制；且插入外源 DNA后，不影響其復(fù)制能力； 具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定； 有克隆位點(diǎn)（外源 DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)； 分子量小，以容納較大的外源 DNA； 具生物安全性。 載體的選擇標(biāo)準(zhǔn) 1. 質(zhì)粒 (plasmid) 2. λ 噬菌體 (λphage) ? 置換 λ載體 – 溶解途徑 載體和外源 DNA整合到宿主菌 DNA中。可克隆 23kb的外源 DNA。 ? 插入載體 – 裂解途徑 DNA在宿主細(xì)胞中復(fù)制，然后包裝成噬菌體，裂解宿主，釋放噬菌體?？煽寺?5kb的 cDNA。 是一種可在體外包裝的細(xì)菌病毒 ,可高效感染大腸桿菌 。 λ噬菌體 DNA是線狀雙鏈 DNA分子 ， 全長約 50kb， 每條鏈各帶 12bp長的單鏈互補(bǔ)末端 粘末端 (COS序列 )。 進(jìn)入宿主細(xì)胞后不久 ， COS序列堿基配對環(huán)化 。 可包裝 37~52kb DNA分子 。 改建后的 λ噬菌體發(fā)展了多種較大型的克隆載體，如 ： (cosmid vector)： 粘粒 是將質(zhì)粒和 λ噬菌體改建的一種載體 .它含 COS序列 ,插入一小plasmid –而得名 Cosmid。 改建后的粘粒含有 λ噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和cos末端 ， 全長 8kb。 可感染大腸桿菌 。 大片段外源 DNA插入后 ，在體外包裝進(jìn)而被克隆 。 可包裝 30~50 kb長的 DNA片段 ， 多用于基因文庫構(gòu)建 。 4. 其他載體：大片段 DNA克隆載體 細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 約 300kb 噬菌體 PI人工染色體 （ PI artificial chromosome, PAC） 約 100kb 酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 200kb — 2021kb 動物病毒 DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒） （四）、外源 DNA片斷和載體的連接 1. 粘性末端連接 方式： (1)同一限制酶切位點(diǎn)連接 (2)不同限制酶切位點(diǎn)連接 配伍末端連接 非配伍末端連接 Bam HⅠ 切割反應(yīng) GGATCC CCTAGG T4 DNA連接酶 15186。C GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ 切割 GC C T A GGC C T A GGA TC CGGA TC CG載體 DNA用 Bam HⅠ 切割 GC C
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