【導(dǎo)讀】定方法對蛋白Pyk2的影響。為以后檢測402位點磷酸化了的Pyk2蛋白在小鼠胚胎細胞內(nèi)的。分布、特征、及其在小鼠胚胎發(fā)育過程中的功能的探究奠定基礎(chǔ)。為以后對Pyk2蛋白的進一步研究打好基礎(chǔ)。Pyk2蛋白免疫熒光染色情況的影響。本實驗是利用技術(shù)對小免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)，用激。光掃描共聚焦顯微鏡進行裝片觀察，并對新的固定及透膜方法進行比較、分析、總結(jié)。了適合本實驗的固定方法為免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)的改進提供了新思路。

　　

【正文】 Pyk2 11 實驗分析 本實驗室常規(guī)固定和透膜小鼠胚胎細胞的方法檢測到蛋白 Pyk2 定位在細胞質(zhì)中，少量定位在細胞連接處，結(jié)果不是很 穩(wěn)定：有時檢測到其在細胞連接處和皮層部分分布較多，有時卻只能在一處檢測到有較多分布，有時卻是兩處都沒有 。因此我們探究一種更有效的固定和透膜卵母細胞的方法，即在固定液中加入少量透膜液，這樣邊固定邊微弱透膜；入試驗結(jié)果所示，可檢測到更多 Pyk2 蛋白定位在細胞質(zhì)、細胞連接處和皮層上，且實驗多 次 重復(fù)后 結(jié)果 比較 穩(wěn)定。該結(jié)果出現(xiàn)的原因可能是，在固定液中加入透膜液，透膜液在固定過程中打孔細胞，使得固定液更容易進入細胞，磷酸化的蛋白 Pyk2 被更好的固定；也可能是固定過程中打孔更容易，使得透膜效果加強，抗體更容易進入細胞與靶蛋白結(jié)合；或者是兩者都有。因此在以后的實驗中，為取得更好的效果，可用此種新的處理方法。 實驗過程中注意挑選健康適齡雌鼠和性成熟的有繁殖能力稍微大點兒的健康雄鼠，傍晚時分打針。取輸卵管時盡量剔除干凈脂肪，用針和尖頭鑷子充分將輸卵管劃開。移胚胎過程中使用的玻璃針補課太粗，否則胚胎容 易調(diào)出 。亦不可太細，太細了特別容易堵；轉(zhuǎn)移胚胎應(yīng)根據(jù)多少分批進行，以防一次轉(zhuǎn)移過程中全部丟失。實驗前檢查實驗器材及試劑是否完好、齊全。二抗使用過程中注意避光， PI 染色時間不可過長也不可過短。封片過程中，向抗熒光猝滅劑中轉(zhuǎn)移胚胎是盡可能少的帶液體，否則壓出的片子容易攤開，胚胎不容易找到。做好的片子放到 20℃冰箱避光保存。 激光掃描共聚焦顯微鏡使用注意事項： 基本步驟如下：（ 1）開啟儀器電源及光源：一般先開啟顯微鏡和激光器，再啟動計算機，然后啟動操作軟件，設(shè)置熒光樣品的激發(fā)光波長，選擇相應(yīng)的濾光鏡組塊。 以便光電倍增管（ photomultipliertube， PMT）檢測器能得到足夠的信號結(jié)果。使用汞燈的注意事項同普通熒光顯微鏡。（ 2）設(shè)置相應(yīng)的掃描方式：在目視模式下．調(diào)整所用物鏡放大倍數(shù)，在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細胞。切換到掃描模式，調(diào)整雙孔針和激光強度參數(shù)，即可得到清晰的共聚焦圖像。（ 3）獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結(jié)果即可。（ 4）關(guān)閉儀器：儀器測定樣品結(jié)束后，先關(guān)閉激光器部分，計算機仍可繼續(xù)進行圖像和數(shù)據(jù)處理。若要退出整個激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)．則應(yīng)該在激光器關(guān)閉后 ，待其冷卻至少 10分鐘后再關(guān)閉計算機及總開關(guān)。獲取三維圖像激光掃描共聚焦顯微鏡具有細胞“ CT”功能，因此，它可以在不損傷細胞的情況下，獲得一系列光學(xué)切片圖像。選用“ ZStack模式，即可實現(xiàn)此項功能。其基本步驟是：①開啟“ ZStack”選項；②確定光學(xué)切片的位置及層數(shù)；③啟動“ Start”，獲得三維圖像。注意事項及維護保養(yǎng)：（ 1）儀器周圍要遠離電磁輻射源（ 2）環(huán)境無震動，無強烈的空氣擾動（ 3）室內(nèi) 12 具有遮光系統(tǒng)，保證熒光樣品不會被外源光漂白； 4）環(huán)境清潔；（ 5）控制工作溫度在5～ 25℃。 13 參考文獻 ： [1]謝穎穎 ,邵華 ,鄭俊克 ,馬恒東 ,李瑞珍 .不同的固定及滲透方法對小鼠卵母細胞免疫熒光染色的影響 [J].上海交通大學(xué) 學(xué)報：醫(yī)學(xué)版， （ 4） :56. [2]蔡月花 , 劉福英 , 王莉 , 王瑜 , 劉軍須 . 近交系 HFJ 大鼠的培育及其部分表型觀察 [J]. 中國實驗動物學(xué)報 , (2): 146149. [3]陳丹青 , 石一復(fù) , 張義龍 . 胎兒卵巢始基卵泡 IGF~IR 表達及臨床意義 [J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展 , (2): 117119. [4]陳官國 . 奶牛的發(fā)情鑒定與適時配種 [J]. 畜禽業(yè) ,20xx. (6): 4445. [5]陳洋 , 陳娟 , 楊永梅 , 姜懷志 . 促卵泡素受體基因的研究概況 [J]. 中國畜牧獸醫(yī) ,20xx. (2): 108111. [6]陳洋 , 王典 , 姜懷志 . 20xx. 動物卵巢血管周期性變化及其與卵巢功能關(guān)系 [J]. 中國畜牧獸醫(yī) ,20xx. 38(7):136140. [7]陳毅斐 , 許程潔 , 王鑫泉 , 徐營 . 小鼠卵巢顆粒細胞適宜培養(yǎng)體系及激素干預(yù)的影響 [J]. 中國組織工程研究 ISTIC, (2): 282286. [8]陳振國 , 許錦階 , 羅麗莉 , 莊曉蘭 , 孔曉霞 , 傅玉才 .姜黃素對新生大鼠卵巢卵泡發(fā)育和卵母細胞凋亡的影響 [J]. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報 ,20xx. 22(004): 193196. [9]戴麗軍 , 葉炳飛 , 黃月玲 . 小鼠超數(shù)排卵的比較試驗 [J]. 上海實驗動物科學(xué) , 20xx. 23(2): 108108 [10]方富貴 , 章孝榮 . 胰島素樣生長因子系統(tǒng)對生殖影響研究進展 [J]. 動物醫(yī)學(xué)進展 , (5): 7679. [11]豐培 金 , 牛淑玲 , 周虛 . 卵泡刺激素受體研究進展 [J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志 , (5): 311316. [12]付建芳 , 黃威權(quán) , 王世鄂 , 初晨宇 . 大鼠下頜下腺卵泡刺激素 , 黃體生成素的分布及與促性腺激素釋放激素受體的共定位研究 [J]. 解剖學(xué)報 , (6): 652655. [13]傅文棟 , 孫玉成 , 索倫 , 高建明 . 小鼠發(fā)情周期觀察與最佳超排時期的確定 [J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報 , (2): 1921. [14]郭慶勇 , 簡子健 , 劉小蘭 , 袁龍 , 況玲 .小鼠發(fā)情周期不同時期超數(shù)排卵效果的研究 [J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 , 20xx. 29(3): 1618. [15]郭慶勇 , 況玲 , 蔣國英 , 劉小蘭 , 袁龍 , 張毅 , 侯宇 , 白亞峰 . 激素的不同劑量對小鼠超數(shù)排卵的影響 [J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) , (7): 14661469. [16]金艷梅 . 顆粒細胞對卵泡發(fā)育的影響 [J]. 中國畜牧獸醫(yī) , 20xx (8): 6972. 14 致謝 本課題在選題及研究過程中得到孟小倩老師的悉心指導(dǎo)。孟 老師一絲不茍的作風(fēng)，嚴謹求實的態(tài)度，踏踏實實的精神， 給予我深刻的影響，使我受益無窮。 從畢業(yè)設(shè)計題目的選擇、到選到課題的研究和論證，再到本畢業(yè)設(shè)計的編寫、修改，每一步都有孟 老師的細心指導(dǎo)和認真的解析。在 孟 老師的指導(dǎo)下，我在各方面都有所提高，老師以嚴謹求實，一絲不茍的治學(xué)態(tài)度和勤勉的工作態(tài)度深深感染了我，給我巨大的啟迪，鼓舞和鞭策，并成為我人生路上值得學(xué)習(xí)的榜樣。使我的知識層次又有所提高。同時感謝所有教育過我的專業(yè)老師，你們傳授的專業(yè)知識是我不斷成長的源泉也是完成本論文的基礎(chǔ)。 感謝崔冰學(xué)姐為我們提供參考資料、精心準(zhǔn)備實驗材料以及在工作和生活中的幫助與關(guān)心。感謝 同一個課題組的柴榮飛、段美芳等同學(xué)，同我一起探討、嘗試，并給我提出寶貴的意見和建議。感謝和我一起度過美好大學(xué)四年的同學(xué)朋友。 通過這次畢業(yè)設(shè)計不僅提高了我獨立思考問題解決問題的能力而且培養(yǎng)了認真嚴謹，一絲不茍的學(xué)習(xí)態(tài)度。由于經(jīng)驗匱乏，能力有限，設(shè)計中難免有許多考慮不周全的地方，希望各位老師多加指教。 再次向各位老師和同學(xué)表示深深的謝意！向我敬重的導(dǎo)師和給予我支持和幫助的同學(xué)表示誠摯的感謝！ 15