【導(dǎo)讀】定方法對(duì)蛋白Pyk2的影響。為以后檢測(cè)402位點(diǎn)磷酸化了的Pyk2蛋白在小鼠胚胎細(xì)胞內(nèi)的。分布、特征、及其在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能的探究奠定基礎(chǔ)。為以后對(duì)Pyk2蛋白的進(jìn)一步研究打好基礎(chǔ)。Pyk2蛋白免疫熒光染色情況的影響。本實(shí)驗(yàn)是利用技術(shù)對(duì)小免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)，用激。光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行裝片觀察，并對(duì)新的固定及透膜方法進(jìn)行比較、分析、總結(jié)。了適合本實(shí)驗(yàn)的固定方法為免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的改進(jìn)提供了新思路。

　　

【正文】 Pyk2 11 實(shí)驗(yàn)分析 本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)固定和透膜小鼠胚胎細(xì)胞的方法檢測(cè)到蛋白 Pyk2 定位在細(xì)胞質(zhì)中，少量定位在細(xì)胞連接處，結(jié)果不是很 穩(wěn)定：有時(shí)檢測(cè)到其在細(xì)胞連接處和皮層部分分布較多，有時(shí)卻只能在一處檢測(cè)到有較多分布，有時(shí)卻是兩處都沒(méi)有 。因此我們探究一種更有效的固定和透膜卵母細(xì)胞的方法，即在固定液中加入少量透膜液，這樣邊固定邊微弱透膜；入試驗(yàn)結(jié)果所示，可檢測(cè)到更多 Pyk2 蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞連接處和皮層上，且實(shí)驗(yàn)多 次 重復(fù)后 結(jié)果 比較 穩(wěn)定。該結(jié)果出現(xiàn)的原因可能是，在固定液中加入透膜液，透膜液在固定過(guò)程中打孔細(xì)胞，使得固定液更容易進(jìn)入細(xì)胞，磷酸化的蛋白 Pyk2 被更好的固定；也可能是固定過(guò)程中打孔更容易，使得透膜效果加強(qiáng)，抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與靶蛋白結(jié)合；或者是兩者都有。因此在以后的實(shí)驗(yàn)中，為取得更好的效果，可用此種新的處理方法。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意挑選健康適齡雌鼠和性成熟的有繁殖能力稍微大點(diǎn)兒的健康雄鼠，傍晚時(shí)分打針。取輸卵管時(shí)盡量剔除干凈脂肪，用針和尖頭鑷子充分將輸卵管劃開(kāi)。移胚胎過(guò)程中使用的玻璃針補(bǔ)課太粗，否則胚胎容 易調(diào)出 。亦不可太細(xì)，太細(xì)了特別容易堵；轉(zhuǎn)移胚胎應(yīng)根據(jù)多少分批進(jìn)行，以防一次轉(zhuǎn)移過(guò)程中全部丟失。實(shí)驗(yàn)前檢查實(shí)驗(yàn)器材及試劑是否完好、齊全。二抗使用過(guò)程中注意避光， PI 染色時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)也不可過(guò)短。封片過(guò)程中，向抗熒光猝滅劑中轉(zhuǎn)移胚胎是盡可能少的帶液體，否則壓出的片子容易攤開(kāi)，胚胎不容易找到。做好的片子放到 20℃冰箱避光保存。 激光掃描共聚焦顯微鏡使用注意事項(xiàng)： 基本步驟如下：（ 1）開(kāi)啟儀器電源及光源：一般先開(kāi)啟顯微鏡和激光器，再啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，然后啟動(dòng)操作軟件，設(shè)置熒光樣品的激發(fā)光波長(zhǎng)，選擇相應(yīng)的濾光鏡組塊。 以便光電倍增管（ photomultipliertube， PMT）檢測(cè)器能得到足夠的信號(hào)結(jié)果。使用汞燈的注意事項(xiàng)同普通熒光顯微鏡。（ 2）設(shè)置相應(yīng)的掃描方式：在目視模式下．調(diào)整所用物鏡放大倍數(shù)，在熒光顯微鏡下找到需要檢測(cè)的細(xì)胞。切換到掃描模式，調(diào)整雙孔針和激光強(qiáng)度參數(shù)，即可得到清晰的共聚焦圖像。（ 3）獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結(jié)果即可。（ 4）關(guān)閉儀器：儀器測(cè)定樣品結(jié)束后，先關(guān)閉激光器部分，計(jì)算機(jī)仍可繼續(xù)進(jìn)行圖像和數(shù)據(jù)處理。若要退出整個(gè)激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)．則應(yīng)該在激光器關(guān)閉后 ，待其冷卻至少 10分鐘后再關(guān)閉計(jì)算機(jī)及總開(kāi)關(guān)。獲取三維圖像激光掃描共聚焦顯微鏡具有細(xì)胞“ CT”功能，因此，它可以在不損傷細(xì)胞的情況下，獲得一系列光學(xué)切片圖像。選用“ ZStack模式，即可實(shí)現(xiàn)此項(xiàng)功能。其基本步驟是：①開(kāi)啟“ ZStack”選項(xiàng)；②確定光學(xué)切片的位置及層數(shù)；③啟動(dòng)“ Start”，獲得三維圖像。注意事項(xiàng)及維護(hù)保養(yǎng)：（ 1）儀器周?chē)h(yuǎn)離電磁輻射源（ 2）環(huán)境無(wú)震動(dòng)，無(wú)強(qiáng)烈的空氣擾動(dòng)（ 3）室內(nèi) 12 具有遮光系統(tǒng)，保證熒光樣品不會(huì)被外源光漂白； 4）環(huán)境清潔；（ 5）控制工作溫度在5～ 25℃。 13 參考文獻(xiàn) ： [1]謝穎穎 ,邵華 ,鄭俊克 ,馬恒東 ,李瑞珍 .不同的固定及滲透方法對(duì)小鼠卵母細(xì)胞免疫熒光染色的影響 [J].上海交通大學(xué) 學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版， （ 4） :56. [2]蔡月花 , 劉福英 , 王莉 , 王瑜 , 劉軍須 . 近交系 HFJ 大鼠的培育及其部分表型觀察 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào) , (2): 146149. [3]陳丹青 , 石一復(fù) , 張義龍 . 胎兒卵巢始基卵泡 IGF~IR 表達(dá)及臨床意義 [J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展 , (2): 117119. [4]陳官?lài)?guó) . 奶牛的發(fā)情鑒定與適時(shí)配種 [J]. 畜禽業(yè) ,20xx. (6): 4445. [5]陳洋 , 陳娟 , 楊永梅 , 姜懷志 . 促卵泡素受體基因的研究概況 [J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī) ,20xx. (2): 108111. [6]陳洋 , 王典 , 姜懷志 . 20xx. 動(dòng)物卵巢血管周期性變化及其與卵巢功能關(guān)系 [J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī) ,20xx. 38(7):136140. [7]陳毅斐 , 許程潔 , 王鑫泉 , 徐營(yíng) . 小鼠卵巢顆粒細(xì)胞適宜培養(yǎng)體系及激素干預(yù)的影響 [J]. 中國(guó)組織工程研究 ISTIC, (2): 282286. [8]陳振國(guó) , 許錦階 , 羅麗莉 , 莊曉蘭 , 孔曉霞 , 傅玉才 .姜黃素對(duì)新生大鼠卵巢卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞凋亡的影響 [J]. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) ,20xx. 22(004): 193196. [9]戴麗軍 , 葉炳飛 , 黃月玲 . 小鼠超數(shù)排卵的比較試驗(yàn) [J]. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué) , 20xx. 23(2): 108108 [10]方富貴 , 章孝榮 . 胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)對(duì)生殖影響研究進(jìn)展 [J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 , (5): 7679. [11]豐培 金 , 牛淑玲 , 周虛 . 卵泡刺激素受體研究進(jìn)展 [J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志 , (5): 311316. [12]付建芳 , 黃威權(quán) , 王世鄂 , 初晨宇 . 大鼠下頜下腺卵泡刺激素 , 黃體生成素的分布及與促性腺激素釋放激素受體的共定位研究 [J]. 解剖學(xué)報(bào) , (6): 652655. [13]傅文棟 , 孫玉成 , 索倫 , 高建明 . 小鼠發(fā)情周期觀察與最佳超排時(shí)期的確定 [J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào) , (2): 1921. [14]郭慶勇 , 簡(jiǎn)子健 , 劉小蘭 , 袁龍 , 況玲 .小鼠發(fā)情周期不同時(shí)期超數(shù)排卵效果的研究 [J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) , 20xx. 29(3): 1618. [15]郭慶勇 , 況玲 , 蔣國(guó)英 , 劉小蘭 , 袁龍 , 張毅 , 侯宇 , 白亞峰 . 激素的不同劑量對(duì)小鼠超數(shù)排卵的影響 [J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) , (7): 14661469. [16]金艷梅 . 顆粒細(xì)胞對(duì)卵泡發(fā)育的影響 [J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī) , 20xx (8): 6972. 14 致謝 本課題在選題及研究過(guò)程中得到孟小倩老師的悉心指導(dǎo)。孟 老師一絲不茍的作風(fēng)，嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的態(tài)度，踏踏實(shí)實(shí)的精神， 給予我深刻的影響，使我受益無(wú)窮。 從畢業(yè)設(shè)計(jì)題目的選擇、到選到課題的研究和論證，再到本畢業(yè)設(shè)計(jì)的編寫(xiě)、修改，每一步都有孟 老師的細(xì)心指導(dǎo)和認(rèn)真的解析。在 孟 老師的指導(dǎo)下，我在各方面都有所提高，老師以嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)，一絲不茍的治學(xué)態(tài)度和勤勉的工作態(tài)度深深感染了我，給我巨大的啟迪，鼓舞和鞭策，并成為我人生路上值得學(xué)習(xí)的榜樣。使我的知識(shí)層次又有所提高。同時(shí)感謝所有教育過(guò)我的專(zhuān)業(yè)老師，你們傳授的專(zhuān)業(yè)知識(shí)是我不斷成長(zhǎng)的源泉也是完成本論文的基礎(chǔ)。 感謝崔冰學(xué)姐為我們提供參考資料、精心準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料以及在工作和生活中的幫助與關(guān)心。感謝 同一個(gè)課題組的柴榮飛、段美芳等同學(xué)，同我一起探討、嘗試，并給我提出寶貴的意見(jiàn)和建議。感謝和我一起度過(guò)美好大學(xué)四年的同學(xué)朋友。 通過(guò)這次畢業(yè)設(shè)計(jì)不僅提高了我獨(dú)立思考問(wèn)題解決問(wèn)題的能力而且培養(yǎng)了認(rèn)真嚴(yán)謹(jǐn)，一絲不茍的學(xué)習(xí)態(tài)度。由于經(jīng)驗(yàn)匱乏，能力有限，設(shè)計(jì)中難免有許多考慮不周全的地方，希望各位老師多加指教。 再次向各位老師和同學(xué)表示深深的謝意！向我敬重的導(dǎo)師和給予我支持和幫助的同學(xué)表示誠(chéng)摯的感謝！ 15