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免疫組化、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用比較及常見問題分析-資料下載頁

2024-10-03 14:07本頁面
  

【正文】 不同波長的熒光。然而,熒光染料所發(fā)出的熒光都具有一定的波長范圍〔寬發(fā)射譜性質(zhì)〕,雖然各自的熒光峰值不同,但發(fā)射譜范圍會有一定的重疊。因而就會造成不同通道之間的熒光干擾,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。 第二十七頁,共三十五頁。 熒光補(bǔ)償示意圖 第二十八頁,共三十五頁。 Annexin VFITC/PI凋亡檢測原理 在細(xì)胞凋亡早期,磷脂酰絲氨酸〔 Phosphatidylserine, PS〕可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表,暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。 Annexin V是一種分子量為 3536kD的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,能與磷脂酰絲氨酸PS高親和力特異性結(jié)合。 將 Annexin V進(jìn)行熒光素〔 FITC、 PE〕或 Biotin標(biāo)記,以標(biāo)記了的 Annexin VFITC作為熒光探針,利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 碘化丙啶〔 Propidium Iodide, PI〕是一種核酸染料,它不能透過完整的細(xì)胞膜,但在細(xì)胞凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞,碘化丙啶 PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將 Annexin V 與 PI 匹配使用,就可以將細(xì)胞凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。 第二十九頁,共三十五頁。 圖片引自 :// bioon /experiment/cellular4/ 第三十頁,共三十五頁。 Annexin VFITC /PI 凋亡檢測結(jié)果分析 第三十一頁,共三十五頁。 熒光強(qiáng)度 /背景過高 一抗 /二抗?jié)舛忍?,建議降低一抗 /二抗?jié)舛取? 封閉不完全,建議增加蛋白封閉時間。 洗滌不充分,建議增加沖洗次數(shù)與時間。 信號弱或無信號 無目的蛋白或表達(dá)量極少,建議選用表達(dá)量高的細(xì)胞。 細(xì)胞通透性差,建議增加通透劑的作用時間或濃度。 一抗 /二抗?jié)舛忍?,建議增大其濃度。 二抗選擇錯誤〔種屬不匹配〕,建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。 柱形圖分析時出現(xiàn)熒光雙峰 抗原本身特性所決定〔比方不同時期的細(xì)胞蛋白表達(dá)量不同〕 進(jìn)樣針堵塞,建議清洗管路。 進(jìn)樣速度太快,建議調(diào)低進(jìn)樣速度。 管路系統(tǒng)偏移導(dǎo)致焦距偏離,建議請專業(yè)維修人員校準(zhǔn)。 流式細(xì)胞術(shù)常見問題分析 第三十二頁,共三十五頁。 IHC、 IF、 FC區(qū)別與聯(lián)系 FC IHC/IF 控制 電腦(客觀) 人(主觀) 結(jié)果顯示方式 熒光激發(fā)后被探測子捕獲信號 化學(xué)顯色 /熒光通過顯微鏡觀察拍片 樣本 單細(xì)胞(或顆粒)懸液(流動) 組織切片 /細(xì)胞爬片 (靜止) 細(xì)胞數(shù)量 大(上萬個) 小 樣本利用 分選后可回收利用 不可回收利用 結(jié)果揭示信息 細(xì)胞群體特征分布 揭示細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息 功能 可同時檢測多個參數(shù) 一般只能檢測一個參數(shù) 第三十三頁,共三十五頁。 第三十四頁,共三十五頁。 內(nèi)容總結(jié) 免疫組化、免疫熒光、。操作過程中沖洗不充分,建議增加沖洗的次數(shù)與沖洗時間。操作過程沖洗過度,建議適度沖洗。一抗種屬來源來源不同??膳c F肌動蛋白結(jié)合,使 F肌動蛋白保持穩(wěn)定。封閉不完全,建議增加蛋白封閉時間。用普通的封片劑封片,建議選用防熒光猝滅劑封片。進(jìn)樣速度太快,建議調(diào)低進(jìn)樣速度。一般只能檢測一個參數(shù) 第三十五頁,共三十五頁。
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